హాట్‌స్టార్ట్ టాక్ DNA పాలిమరేస్
హాట్ స్టార్ట్ టాక్ DNA పాలిమరేస్ (యాంటీబాడీ మోడిఫికేషన్) అనేది 5′→3′ పాలిమరేస్ యాక్టివిటీ మరియు 5´ ఫ్లాప్ ఎండోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉన్న థర్మస్ ఆక్వాటికస్ YT-1 నుండి వచ్చిన హాట్-స్టార్ట్ థర్మోస్టేబుల్ DNA పాలిమరేస్.హాట్-స్టార్ట్ టాక్ DNA పాలిమరేస్ అనేది ఒక Taq DNA పాలిమరేస్, ఇది థర్మోలాబైల్ Taq యాంటీబాడీస్ ద్వారా సవరించబడింది.యాంటీబాడీ సవరణ PCR యొక్క నిర్దిష్టత, సున్నితత్వం మరియు దిగుబడిని పెంచింది.
భాగాలు
| భాగం | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC టాక్ బఫర్ | 4×1 మి.లీ | 4×10 మి.లీ | 4×50 మి.లీ | 5×400 మి.లీ |
| హాట్ స్టార్ట్ టాక్ DNA పాలిమరేస్ (యాంటీబాడీ సవరించబడింది) (5 U/μL) | 0.1 మి.లీ | 1 మి.లీ | 5 మి.లీ | 10×5 మి.లీ |
అప్లికేషన్లు
10 mM Tris-HCl (25℃ వద్ద pH 7.4), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM డిథియోత్రీటాల్, 0.5% ట్వీన్20, 0.5% IGEPALCA-630 మరియు 50% గ్లిసరాల్.
నిల్వ పరిస్థితి
రవాణా 0°C కంటే తక్కువ మరియు -25°C~-15°C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.
యూనిట్ నిర్వచనం
ఒక యూనిట్ 75°C వద్ద 30 నిమిషాలలో 15 nmol dNTPని యాసిడ్ కరగని పదార్థంలో చేర్చే ఎంజైమ్ మొత్తంగా నిర్వచించబడింది.
నాణ్యత నియంత్రణ
1.Endonuclease కార్యాచరణ:37℃ వద్ద 4 గంటలపాటు 4 μg pUC19 DNAతో 20 U ఎంజైమ్‌ను పొదిగించడం వలన జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన DNA యొక్క గుర్తించదగిన క్షీణత లేదు.
2.5 kb లాంబ్డా PCR:200 µM dNTPలు మరియు 0.2 µM ప్రైమర్‌ల సమక్షంలో 1.25 యూనిట్ల Taq DNA పాలిమరేస్‌తో 5 ng లాంబ్డా DNA యొక్క 25 చక్రాల PCR విస్తరణ ఆశించిన 5 kb ఉత్పత్తికి దారి తీస్తుంది.
3.Exonuclease కార్యాచరణ:10 nmol 5´-FAM ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌తో 10 nmol 5´-FAM ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌తో 37℃ వద్ద 30 నిమిషాల పాటు కనీసం 12.5 U Taq DNA పాలీమరేస్‌ను కలిగి ఉన్న 50 µl ప్రతిచర్యను 37℃ దిగుబడి గుర్తించదగిన క్షీణతను ఇవ్వదు.
4.RNase కార్యాచరణ:37°C వద్ద 2 గంటల పాటు 1μg RNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లతో 20 U ఎంజైమ్‌ను కలిగి ఉన్న 10 µL ప్రతిచర్యను పొదిగించడం వలన జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన RNA యొక్క గుర్తించదగిన క్షీణత లేదు.
5.వేడి నిష్క్రియం:నం.
ప్రతిచర్య వ్యవస్థ
| భాగాలు | వాల్యూమ్ |
| టెంప్లేట్ DNAa | ఐచ్ఛికం |
| 10 μM ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ | 0.5 μL |
| 10 μM రివర్స్ ప్రైమర్ | 0.5 μL |
| dNTP మిక్స్ (ఒక్కొక్కటి 10mM) | 0.5 μL |
| 5×HC టాక్ బఫర్ | 5 μL |
| టాక్ DNA పాలిమరేస్బి(5U/μL) | 0.125 μL |
| న్యూక్లీజ్ లేని నీరు | 25 μL వరకు |
గమనికలు:
1) a.
| DNA | మొత్తం |
| జెనోమిక్ | 1 ng-1 μg |
| ప్లాస్మిడ్ లేదా వైరల్ | 1 pg-1 ng |
2) బి.ప్రత్యేక అనువర్తనాల్లో Taq DNA పాలిమరేస్ యొక్క సరైన సాంద్రత 5-50 యూనిట్లు/mL (0.1-0.5 యూనిట్లు/25 µL ప్రతిచర్య) వరకు ఉండవచ్చు.
థర్మల్ సైక్లింగ్ ప్రోటోకాల్
PCR
| దశ | ఉష్ణోగ్రత(°C) | సమయం | సైకిళ్లు |
| ప్రారంభ డీనాటరేషన్a | 95 ℃ | 1-3 నిమిషాలు | - |
| డీనాటరేషన్ | 95 ℃ | 15-30 సె | 30-35 సైకిళ్లు |
| ఎనియలింగ్బి | 45-68 ℃ | 15-60 సె | |
| పొడిగింపు | 68 ℃ | 1kb/నిమి | |
| చివరి పొడిగింపు | 68 ℃ | 5 నిమిషాలు | - |
గమనికలు:
1) చాలా యాంప్లిఫికేషన్‌లకు 95°C వద్ద 1 నిమిషం ప్రారంభ డీనాటరేషన్ సరిపోతుంది.కష్టతరమైన టెంప్లేట్‌ల కోసం, 95°C వద్ద 2-3నిమిషాల సుదీర్ఘ డీనాటరేషన్ సిఫార్సు చేయబడింది.కాలనీ PCRతో, 95°C వద్ద ప్రారంభ 5నిమిషాల డీనాటరేషన్ సిఫార్సు చేయబడింది.
2) ఎనియలింగ్ దశ సాధారణంగా 15-60 సె.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ప్రైమర్ జత యొక్క Tmపై ఆధారపడి ఉంటుంది మరియు సాధారణంగా 45-68℃ ఉంటుంది.
