RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్
RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ అనేది RNA టెంప్లేట్-ఆధారిత DNA పాలిమరేస్, ఇది 3'→5' ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉండదు మరియు RNase H కార్యాచరణను కలిగి ఉంటుంది.ఈ ఎంజైమ్ DNA యొక్క కాంప్లిమెంటరీ స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేయడానికి RNAను ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు, ఇది మొదటి-స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణకు, ప్రత్యేకించి RT-LAMP (లూప్-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్) కోసం వర్తించబడుతుంది.RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ 1.0తో పోలిస్తే, సున్నితత్వం గణనీయంగా మెరుగుపడింది, ఉష్ణ స్థిరత్వం బలంగా ఉంటుంది మరియు 65°C వద్ద ప్రతిచర్య మరింత స్థిరంగా ఉంటుంది.RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (గ్లిసరాల్ ఫ్రీ)ని లైయోఫైలైజ్డ్ ప్రిపరేషన్స్, లైయోఫైలైజ్డ్ RT-LAMP రియాజెంట్స్ మొదలైనవాటిని సిద్ధం చేయడానికి ఉపయోగించవచ్చు.
యూనిట్ నిర్వచనం
ఒక యూనిట్ పాలీ(A)•ఒలిగో(dT)25ని టెంప్లేట్-ప్రైమర్‌గా ఉపయోగించి 50°C వద్ద 20 నిమిషాలలో 1 nmol dTTPని యాసిడ్-అవక్షేపణ పదార్థంలో చేర్చుతుంది.
భాగాలు
| భాగం | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (గ్లిసరాల్ లేనిది) (15U/μL) | 0.1 మి.లీ | 1 మి.లీ | 10 మి.లీ |
| 10×HC RTL బఫర్ | 1.5 మి.లీ | 4×1.5 మి.లీ | 5×10 మి.లీ |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 మి.లీ | 2×1.5 మి.లీ | 3×10 మి.లీ |
నిల్వ పరిస్థితి
రవాణా 0°C కంటే తక్కువ మరియు -25°C~-15°C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.
నాణ్యత నియంత్రణ
- యొక్క అవశేష కార్యాచరణEనాన్యూకలీస్:1 μg λDNA మరియు 15 యూనిట్ల RTL2.0 కలిగి ఉన్న 50 μL ప్రతిచర్య 37 ℃ వద్ద 16 గంటల పాటు పొదిగేది జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ప్రతికూల నియంత్రణ వలె అదే నమూనాను చూపుతుంది.
- యొక్క అవశేష కార్యాచరణఎక్సోన్యూకలీస్:1 μg హింద్ Ⅲ జీర్ణమైన λDNA మరియు 37 ℃ వద్ద 16 గంటల పాటు పొదిగే 15 యూనిట్ల RTL2.0 కలిగిన 50 μL ప్రతిచర్య జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ప్రతికూల నియంత్రణ వలె అదే నమూనాను చూపుతుంది.
- యొక్క అవశేష కార్యాచరణనికేస్:ఒక 50 μL ప్రతిచర్య 1 μg సూపర్‌కాయిల్డ్ pBR322 మరియు 15 యూనిట్ల RTL2.0 37°C వద్ద 4 గంటలపాటు పొదిగేది, జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ప్రతికూల నియంత్రణ వలె అదే నమూనాను చూపుతుంది.
- యొక్క అవశేష కార్యాచరణRNase:10 μL ప్రతిచర్య 0.48 μg MS2 RNA మరియు 15 యూనిట్ల RTL2.0 37°C వద్ద 4 గంటలపాటు పొదిగినది జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ప్రతికూల నియంత్రణ వలె అదే నమూనాను చూపుతుంది.
- E. కోలి gDNA:తో కొలుస్తారుE.coliనిర్దిష్ట HCD డిటెక్షన్ కిట్‌లు，RTL2.0 యొక్క 15 యూనిట్లు 1 కంటే తక్కువ కలిగి ఉంటాయిE. కోలిజన్యువు.
ప్రతిచర్య సెటప్
cDNA సింథసిస్ ప్రోటోకాల్
| భాగాలు | వాల్యూమ్ |
| టెంప్లేట్ RNA a | ఐచ్ఛికం |
| ఒలిగో(dT) 18~25(50uM) లేదా రాండమ్ ప్రైమర్ మిక్స్(60uM) | 2 μL |
| dNTP మిక్స్ (ఒక్కొక్కటి 10mM) | 1 μL |
| RNase ఇన్హిబిటర్ (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL బఫర్ | 2 μL |
| న్యూక్లీజ్ లేని నీరు | 20 μL వరకు |
గమనికలు:
1) మొత్తం RNA యొక్క సిఫార్సు మోతాదు 1ng~1μg
2) mRNA యొక్క సిఫార్సు మోతాదు 50ng~100ng
థర్మో-రొటీన్ కోసం సైక్లింగ్ పరిస్థితులు స్పందన:
| ఉష్ణోగ్రత (°C) | సమయం |
| 25 °Ca | 5 నిమిషాలు |
| 55 °C | 10 నిమిషాలుb |
| 80 °C | 10 నిమిషాలు |
గమనికలు:
1) రాండమ్ ప్రైమర్ మిక్స్ ఉపయోగించినట్లయితే, 25°C వద్ద పొదిగే దశ.
2) టార్గెట్ ప్రైమర్ మిశ్రమాన్ని ఉపయోగించినట్లయితే, 10~30నిమిషాల పాటు 55°C వద్ద పొదిగే దశ.
RT-LAMP ప్రోటోకాల్
| భాగాలు | వాల్యూమ్ | చివరి ఏకాగ్రత |
| టెంప్లేట్ RNA | ఐచ్ఛికం | ≥10 కాపీలు |
| dNTP మిక్స్ (10mM) | 3.5 μL | 1.4 మి.మీ |
| FIP/BIP ప్రైమర్‌లు (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 ప్రైమర్‌లు (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB ప్రైమర్‌లు (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase ఇన్హిబిటర్ (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/ప్రతిస్పందన |
| RTL రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/ప్రతిస్పందన |
| Bst V2 DNA పాలిమరేస్ (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ప్రతిస్పందన |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (మొత్తం 8 mM) |
| 10×HC RTL బఫర్ (లేదా 10×HC Bst V2 బఫర్) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| న్యూక్లీజ్ లేని నీరు | 25 μL వరకు | - |
గమనికలు:
1) సేకరించడానికి క్లుప్తంగా వోర్టెక్సింగ్ మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ ద్వారా కలపండి.1 గంటకు 65°C వద్ద స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత పొదిగేది.
2) రెండు బఫర్‌లు పరస్పరం పనిచేయగలవి మరియు ఒకే కూర్పును కలిగి ఉంటాయి.
గమనికలు
1.ఈ ఉత్పత్తి -20 °C వద్ద నిల్వ చేయబడినప్పుడు తెల్లటి ఘనపదార్థాన్ని ఏర్పరుస్తుంది.-20 ° C నుండి తీసివేసి, సుమారు 10 నిమిషాలు మంచు మీద ఉంచండి.కరిగిన తర్వాత, అది వణుకు మరియు కలపడం ద్వారా ఉపయోగించవచ్చు.
2.CDNA ఉత్పత్తిని -20°C లేదా -80°C వద్ద నిల్వ చేయవచ్చు లేదా PCR ప్రతిచర్య కోసం వెంటనే ఉపయోగించవచ్చు.
3.RNase కాలుష్యాన్ని నిరోధించడానికి, దయచేసి ప్రయోగాత్మక ప్రాంతాన్ని శుభ్రంగా ఉంచండి మరియు ఆపరేషన్ సమయంలో శుభ్రమైన చేతి తొడుగులు మరియు ముసుగులు ధరించండి.
