mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA క్యాప్ 2´ -O-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ వ్యాక్సినియా mRNA క్యాప్ 2 ´-O-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ కోసం జన్యువును కలిగి ఉండే రీకాంబినెంట్ E. కోలి జాతి నుండి తీసుకోబడింది.ఈ ఎంజైమ్ RNA యొక్క 5´ ముగింపులో క్యాప్ నిర్మాణం ప్రక్కనే ఉన్న మొదటి న్యూక్లియోటైడ్ యొక్క 2´-O స్థానంలో మిథైల్ సమూహాన్ని జోడిస్తుంది. ఎంజైమ్ S-అడెనోసిల్మెథియోనిన్ (SAM)ని మిథైల్ క్యాప్డ్ RNA (క్యాప్)కి మిథైల్ దాతగా ఉపయోగిస్తుంది. -0) క్యాప్-1 నిర్మాణం ఫలితంగా.

Cap1 నిర్మాణం ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ మరియు మైక్రోఇన్‌జెక్షన్ ప్రయోగాలలో mRNA యొక్క వ్యక్తీకరణను మెరుగుపరుస్తుంది, అనువాద సామర్థ్యాన్ని పెంచుతుంది.ఈ ఎంజైమ్‌కు ప్రత్యేకంగా m7GpppN క్యాప్‌తో కూడిన RNA అవసరం.ఇది 5´ ముగింపులో pN, ppN, pppN లేదా GpppNతో RNAను ఉపయోగించదు.క్యాప్ అనలాగ్‌ని ఉపయోగించి ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ద్వారా లేదా వ్యాక్సినియా క్యాపింగ్ ఎంజైమ్‌ని ఉపయోగించి ఎంజైమాటిక్ క్యాపింగ్ ద్వారా క్యాప్డ్ RNA తయారు చేయబడుతుంది.

భాగాలు

mRNA క్యాప్ 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×క్యాపింగ్ రియాక్షన్ బఫర్

నిల్వ

-25 ～- 15℃ నిల్వ కోసం

నిల్వ బఫర్

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% ట్రిటాన్ X- 100， 50% గ్లిసరాల్.

యూనిట్ నిర్వచనం

37°C వద్ద 1 గంటలో 80 nt క్యాప్డ్ RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ యొక్క 10 pmols మిథైలేట్ చేయడానికి అవసరమైన ఎంజైమ్ మొత్తంగా ఒక యూనిట్ నిర్వచించబడింది.

నాణ్యత నియంత్రణ పరీక్షలు

ఎక్సోన్యూకలీస్:50U యొక్క mRNA క్యాప్ 2 ´ -O-Methyltransferase తో 1μg λ-Hind III డైజెస్ట్ DNA 37 ℃ వద్ద 16 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన విధంగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

ఎండోన్యూక్లీస్: 50 U యొక్క mRNA క్యాప్ 2 ´ -O-Methyltransferase తో 1 μg λDNA 37℃ వద్ద 16 గంటల పాటు అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన విధంగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

నికేస్: 50U యొక్క mRNA క్యాప్ 2 ´ -O-Methyltransferase 37 ℃ వద్ద 1μg pBR322తో 16 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన క్షీణతను అందించదు.

RNase: 50U యొక్క mRNA క్యాప్ 2 ´ -O-Methyltransferase తో 1.6μg MS2 RNA 37℃ వద్ద 4 గంటల పాటు అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన విధంగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

E. కోలి DNA: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase ఉనికి కోసం పరీక్షించబడిందిE. కోలి నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లతో TaqMan qPCR ఉపయోగించి జన్యుసంబంధమైన DNAE. కోలి 16S rRNA లోకస్.దిE. కోలి జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యం =1E. కోలి జన్యువు.

బాక్టీరియల్ ఎండోటాక్సిన్: LAL-పరీక్ష, చైనీస్ ఫార్మకోపోయియా IV 2020 ఎడిషన్ ప్రకారం, జెల్ పరిమితి పరీక్ష పద్ధతి, సాధారణ నియమం (1143).బాక్టీరియల్ ఎండోటాక్సిన్ కంటెంట్ =10 EU/mg ఉండాలి.

ప్రతిచర్య వ్యవస్థ మరియు పరిస్థితులు

1. 1.5 mL మైక్రోఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో తగిన మొత్తంలో క్యాప్డ్ RNA మరియు RNase-రహిత H2Oని 16.0 µL తుది వాల్యూమ్‌కు కలపండి.

2. 65℃ వద్ద 5 నిమిషాలు వేడి చేయండి, తర్వాత 5 నిమిషాలు ఐస్ బాత్ చేయండి.

3. పేర్కొన్న క్రమంలో కింది భాగాలను జోడించండి (క్యాప్డ్ RNA యొక్క మిథైలేషన్ కోసం

10 కంటే తక్కువ

*10× క్యాపింగ్ రియాక్షన్ బఫర్: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 1 గంట పాటు 37℃ వద్ద పొదిగించండి (200 nt కంటే తక్కువ లక్ష్య భాగానికి 2 గంటల పొదిగే సిఫార్సు చేయబడింది).

అప్లికేషన్లు

మైక్రోఇన్‌జెక్షన్ మరియు ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ ప్రయోగాల సమయంలో mRNA వ్యక్తీకరణను మెరుగుపరచడానికి.

ఉపయోగంపై గమనికలు

1. ప్రతిచర్యకు ముందు, RNA శుద్ధి చేయబడాలి మరియు న్యూక్లీజ్ లేని నీటిలో కరిగించబడాలి, అన్ని పరిష్కారాలలో EDTA మరియు అయాన్లు ఉండకూడదు.

2. ట్రాన్స్క్రిప్ట్ యొక్క 5´ ముగింపులో ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని తొలగించడానికి ప్రతిచర్యకు ముందు నమూనా RNA ను 65℃ వద్ద 5 నిమిషాలు వేడి చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.సంక్లిష్టమైన 5´-టెర్మినల్ నిర్మాణం కోసం దీనిని 10 నిమిషాలకు పొడిగించవచ్చు.