Rnase అస్సే కిట్ (ఫ్లోరోసెన్స్)

అప్లికేషన్

నమూనాలలో RNase కాలుష్యాన్ని గుర్తించడానికి ఈ కిట్ ఉపయోగించబడుతుంది.

Cప్రత్యర్థులు

నిల్వ మరియు స్థిరత్వం

1. రవాణా -25 ~ – 15 ℃;

2.కిట్ యొక్క వివిధ భాగాలు ఉష్ణోగ్రత ప్రకారం విడిగా నిల్వ చేయబడతాయి:

3. తెరవని కిట్‌ను 12 నెలలు నిల్వ చేయండి.

4.కిట్ తెరిచిన తర్వాత 6 నెలల పాటు నిల్వ చేయండి.కాంతి మరియు పదేపదే గడ్డకట్టడం మరియు ద్రవీభవనాన్ని నివారించడానికి, RNA ప్రోబ్ సొల్యూషన్‌ను సింగిల్ యూజ్ మొత్తం ప్రకారం ఆల్కాట్ చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

అవసరమైన పరికరాలు మరియు వినియోగ వస్తువులు

1.ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (ex/em=535/575nm తరంగదైర్ఘ్యంతో సహా)

2. DNase&RNase-రహిత పైపెట్‌లు మరియు చిట్కాలు

3. DNase&RNase-రహిత EP ట్యూబ్

4. DNase&RNase-రహిత నలుపు పారదర్శకత లేని 96-బావి ప్లేట్

రియాజెంట్ తయారీ

1.కిట్‌ను తీసి గది ఉష్ణోగ్రతకు (18~25℃) సమతౌల్యం చేయండి, 10× రియాక్షన్ సొల్యూషన్, TE బఫర్, RNase A స్టాండర్డ్ (10mg/mL), స్టాండర్డ్ డైల్యూషన్ బఫర్ వంటి భాగాలను షేక్ చేసి కలపండి, ఆపై వెంటనే సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.(10 సెకన్లకు 4000~7000rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్).

 2. 60 సెకన్ల పాటు RNA ప్రోబ్‌ను 4000~7000rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, దానిని ట్యూబ్ దిగువకు సేకరించి, ట్యూబ్ క్యాప్‌ను జాగ్రత్తగా తెరిచి, RNA ప్రోబ్ స్టోరేజ్ సొల్యూషన్‌గా కరిగిపోయేలా 40μL TE బఫర్‌ను జోడించండి, దాని ప్రకారం RNA ప్రోబ్ స్టోరేజ్ సొల్యూషన్‌ను ఆల్కాట్ చేయండి. ఒకే వినియోగ మొత్తానికి మరియు వాటిని -25 ~ -15 °C వద్ద నిల్వ చేయండి.మీరు పరీక్షించిన ప్రతిసారీ ప్రోబ్ స్టోరేజ్ సొల్యూషన్‌ను తీయండి, TE బఫర్‌తో 50 సార్లు పలుచన చేయండి (ఉదాహరణకు, 490μL TE బఫర్‌ను 12μL RNA ప్రోబ్‌లో జోడించండి) RNA ప్రోబ్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్‌గా.కాంతి మరియు పదేపదే గడ్డకట్టడం మరియు కరిగిపోకుండా ఉండటానికి మిగిలిన RNA ప్రోబ్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్‌ను-25 ~ -15 °C వద్ద నిల్వ చేయండి.

గుర్తింపు దశలు

1. సున్నితత్వం నష్టం లేదా సిగ్నల్ ఓవర్‌సాచురేషన్ ప్రమాదాన్ని నివారించడానికి మొదటి పరీక్షకు ముందు తగిన లాభాలను సెట్ చేయడానికి దశ.

1) సాధన పారామితులు:

గుర్తించే ముందు ప్లేట్ 10~ 15సె షేకింగ్;

ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యం λEx=535nm;

ఉద్గార తరంగదైర్ఘ్యం λEm=575nm;

స్వయంచాలక లాభం ఫంక్షన్ ఉపయోగించండి;

ఉష్ణోగ్రత 37℃;

ఎండ్‌పాయింట్ మోడ్.

వీలైతే లాభాలను ఆటో-స్కేల్‌కి సెట్ చేయండి, ప్రత్యామ్నాయంగా ప్రారంభంలో మీడియం గెయిన్ సెట్టింగ్‌ని ఉపయోగించండి.

గమనిక: వివిధ సాధనాల సెట్టింగ్ విధానం స్థిరంగా లేదు, దయచేసి వివరాల కోసం పరికరం సరఫరాదారుని సంప్రదించండి.

2) 96-బావి పలకపై 2 బావులను ఎంచుకోండి, ప్రతి బావికి 10μL RNA ప్రోబ్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్ మరియు 10μL 10×రియాక్షన్ సొల్యూషన్ జోడించండి;

3) ఒక బావికి 80μL DNase&RNase-రహిత నీటిని జోడించండి మరియు మరొక బావికి 79μL DNase&RNase-రహిత నీటిని మరియు 1μL RNase A ప్రమాణాన్ని (100mg/mL) జోడించండి.

4) 37 ° C వద్ద చీకటి ప్రదేశంలో ప్లేట్ ఉంచండి మరియు 30 నిమిషాల తర్వాత దాన్ని పరీక్షించండి.

5) గెయిన్‌ని ఆటోస్కేల్‌కి సెట్ చేస్తే, డేటా ఫైల్ యొక్క ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ పారామీటర్ బార్‌లో గెయిన్ విలువ ప్రదర్శించబడుతుంది, ఇది G1గా సూచించబడుతుంది.

6) ప్రారంభంలో మీడియం లాభం సెట్టింగ్‌ని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, ఇది గమనించాలి: అధిక ఫ్లోరోసెన్స్ విలువ పరికరం యొక్క ఎగువ పరిమితిని మించి ఉంటే, లాభం విలువను తగిన విధంగా తగ్గించాలి;అధిక ఫ్లోరోసెన్స్ విలువ పరికరం యొక్క ఎగువ పరిమితి కంటే చాలా తక్కువగా ఉంటే, లాభం విలువను తగిన విధంగా పెంచాలి;చివరగా, తగిన లాభం విలువ పొందబడుతుంది, ఇది G2గా సూచించబడుతుంది.

2. ఎస్మరియు సాధన పారామితులు:

గుర్తించే ముందు ప్లేట్ 10~ 15సె షేకింగ్;

ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యం λEx=485nm;

ఉద్గార తరంగదైర్ఘ్యం λEm=525nm;

స్టెప్1లో పొందే లాభం విలువను G1 లేదా G2కి సెట్ చేయండి;

ఉష్ణోగ్రత 37℃;

మైక్రోప్లేట్ రీడర్ కైనెటిక్ మోడ్‌కు మద్దతిస్తుంటే, 1 నుండి 1.5 నిమిషాల విరామంతో కైనెటిక్ డిటెక్షన్ మోడ్‌ని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది మరియు మొత్తం సమయం 30 నిమిషాలు.

3.నమూనా తయారీ

సిఫార్సు చేయబడిన నమూనా వాల్యూమ్ 80μL.పరీక్షించాల్సిన నమూనా 80μL కంటే తక్కువగా ఉంటే, DNase＆RNase-రహిత నీటితో 80μL వరకు పలుచన చేయండి.

పరీక్షించాల్సిన నమూనాలో ఫ్లోరోఫోర్ యొక్క ప్రకాశాన్ని ప్రభావితం చేసే పదార్థాలు (డార్క్ సొల్యూషన్‌లు, అధిక సాంద్రత కలిగిన జిగట పదార్థాలు లేదా సర్ఫ్యాక్టెంట్లు వంటివి) కలిగి ఉన్నప్పుడు, నమూనాను DNase&RNase-రహిత నీటితో కరిగించాలి, అయితే డైల్యూషన్ ఆపరేషన్ ప్రభావితం చేస్తుందని దయచేసి గమనించండి. సున్నితత్వం.RNase కార్యాచరణ నిరోధకాలు (అధిక అయానిక్ స్ట్రెంగ్త్ సొల్యూషన్స్, pH<4 లేదా pH>9 బఫర్‌లు, ప్రొటీన్ డీనాటరెంట్‌లు మొదలైనవి) కలిగి ఉన్న నమూనాను పరీక్షించడానికి, కొలత ఫలితం నమూనా ద్రావణం యొక్క మొత్తం ఎంజైమ్ కార్యాచరణ, కాదు ఎంజైమ్ యొక్క వ్యక్తిగత కార్యాచరణ.

స్టాండర్డ్ డైల్యూషన్ బఫర్‌తో DNase I ప్రమాణాన్ని (10mg/mL) కింది విధంగా పలుచన చేయండి: 

 నం. 5 నమూనాను DNase&RNase-రహిత నీటితో 10 సార్లు పలుచన చేయండి:

సంఖ్య 6 నమూనా సానుకూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడుతుంది;DNase&RNase-రహిత నీరు ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడుతుంది.

4.మోతాదు మరియు పరీక్ష

1) 96-బావి ప్లేట్‌కు 10μL RNA ప్రోబ్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్ మరియు 10μL 10× రియాక్షన్ సొల్యూషన్ జోడించండి.ప్రతికూల నియంత్రణ మరియు సానుకూల నియంత్రణను వరుసగా జోడించడానికి 4 బావులను మరియు పరీక్షించాల్సిన నమూనాలను జోడించడానికి ఇతర బావులను ఎంచుకోండి.ప్రతి నమూనాకు 2 బహుళ బావులు ఉన్నాయి, ప్రతి బావికి 80μL;

2) వెంటనే ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ విలువ RFU0ని 0నిమిషానికి పరీక్షించి, చదవండి.30నిమిషాల పాటు 37 ℃ వద్ద చీకటిలో ఉంచిన తర్వాత, ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ విలువ RFU30ని మళ్లీ 30నిమిషాలకు పరీక్షించి, చదవండి.డైనమిక్ మోడ్‌ని అవలంబిస్తే, 0~30నిమి వరకు అన్ని ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌లు చదవబడతాయి.

పరీక్ష ఫలితాల వివరణ

RFU30≥2×RFU0 అయితే, పరీక్షించాల్సిన నమూనా RNase ద్వారా కలుషితమైందని పరిగణించబడుతుంది.

గమనిక: పరీక్షించాల్సిన నమూనా తీవ్రంగా కలుషితమై లేదా అంతరాయం కలిగించే పదార్థాలను కలిగి ఉంటే, అది RFU0 (పరీక్షించాల్సిన నమూనా) > RFU0 (పాజిటివ్ నాణ్యత నియంత్రణ) మరియు RFU30 (పరీక్షించాల్సిన నమూనా) < 2 ×RFU0 (నమూనా పరీక్షించబడింది), తప్పుడు ప్రతికూల తీర్పుకు దారితీసింది.ఈ సమయంలో, పరీక్షించాల్సిన నమూనాను ముందుగా DNase&RNase-రహిత నీటితో కరిగించి, ఆపై పరీక్షించాలి.

పరిమాణాత్మక గుర్తింపు

పరీక్షించాల్సిన నమూనా కలుషితమై ఉన్నప్పుడు మరియు నమూనాలో RNase యొక్క ఏకాగ్రత విలువను నిర్ధారించడం అవసరం అయినప్పుడు, దానిని క్రింది విధానాల ద్వారా నిర్ణయించవచ్చు:

కింది విధంగా ప్రామాణిక డైల్యూషన్ బఫర్‌తో RNase A ప్రమాణాన్ని (10mg/mL) పలుచన చేయండి:

తర్వాత నం. 6 ~ నం. 9 నమూనాలను DNase & RNase లేని నీటితో 10 సార్లు పలుచన చేయండి:

No. 10 ~ No. 13 నమూనాలు ప్రమాణాలుగా ఉపయోగించబడతాయి;DNase ＆ 0-ఏకాగ్రత నమూనాగా RNase-రహిత నీరు.

RFU0 మరియు RFU30 పొందేందుకు గుర్తింపు దశల ప్రకారం 0-ఏకాగ్రత నమూనా, ప్రమాణాలు మరియు కలుషితమైన నమూనాను కలిపి పరీక్షించండి.

∆RFU = RFU30-RFU0ని లెక్కించండి, ∆RFU (0 ఏకాగ్రత) మరియు ∆RFU (ప్రామాణికం)ను ఆర్డినేట్‌గా తీసుకోండి మరియు RNase ఏకాగ్రతను abscissa (0 గాఢత 0)గా పరిగణించండి, లీనియర్ ఫిట్టింగ్‌ని నిర్వహించి, ఫిట్టింగ్ సమీకరణాన్ని లెక్కించండి = ax + B, మరియు సహసంబంధ గుణకం r ≥ 0.99 ఉండాలి.∆RFU (కలుషితమైన నమూనా)ని సమీకరణంలోకి yగా తీసుకురండి, xని లెక్కించండి మరియు కలుషితమైన నమూనా యొక్క ఉజ్జాయింపు ఏకాగ్రత విలువను పొందేందుకు నమూనా ప్రీ-డైల్యూషన్ మల్టిపుల్‌తో గుణించండి.

గమనిక: ఇన్స్ట్రుమెంట్ సిగ్నల్ యొక్క హెచ్చుతగ్గుల కారణంగా, ∆RFU<0, ఈ సమయంలో, ఇది ∆RFU=0గా లెక్కించబడుతుంది.

గుర్తింపు పనితీరు

1. గుర్తింపు పరిమితి:RNase A: 0.313pg/mL,~ 1.56×10-9U/μL

2.ఖచ్చితత్వం: వైవిధ్యం యొక్క ఇంట్రా బ్యాచ్ గుణకం ≤ 10%, వైవిధ్యం యొక్క ఇంటర్ బ్యాచ్ గుణకం ≤ 15%

శ్రద్ధ

1. నమూనా జోడించే ఆపరేషన్ వీలైనంత వేగంగా ఉండాలి.చాలా ఎక్కువ సమయం ప్రయోగం యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.

2. వివిధ ఫ్లోరోసెంట్ ఎంజైమ్ లేబులింగ్ సాధనాల పారామితులు భిన్నంగా ఉంటాయి.మొదటి పరీక్షకు ముందు తగిన లాభాలను సెట్ చేయండి.

3. అన్ని కారకాలు ఉపయోగం ముందు పూర్తిగా కదిలించబడతాయి.నమూనాలను జోడించేటప్పుడు, జోడించిన నమూనాలను బావి గోడ ఎగువ భాగానికి జోడించకుండా ఉండటానికి ఎంజైమ్ లేబుల్ ప్లేట్ దిగువకు జోడించాలి.నమూనాలను జోడించేటప్పుడు, బుడగలు స్ప్లాష్ లేదా ఉత్పత్తి చేయకుండా జాగ్రత్త వహించండి.

4. కిట్‌లోని ప్రమాణం RNase A, మరియు దాని క్రియాశీల యూనిట్ ఎంజైమ్ యొక్క ఒక యూనిట్‌గా నిర్వచించబడింది, ఈస్ట్ RNA 37 °C మరియు pH 5.0 వద్ద హైడ్రోలైజ్ చేయబడినప్పుడు 260 nm వద్ద 1.0 శోషణ పెరుగుదలకు కారణమవుతుంది[1].యాభై యూనిట్లు 1 కునిట్జ్ యూనిట్[2]కి దాదాపు సమానం.

5.బాహ్య RNase కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి, DNase RNase అవే ప్రయోగాత్మక పట్టిక, చేతి తొడుగులు మరియు ఇతర ఉపరితలాలపై స్ప్రే చేయవచ్చు.5 నిమిషాల తర్వాత, వాటిని శుభ్రమైన కాగితపు తువ్వాలతో శుభ్రం చేసి, తదుపరి ప్రయోగాత్మక కార్యకలాపాలను నిర్వహించండి.