అధిక దిగుబడి T7 ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాజెంట్ (థర్మోస్టేబుల్)

భాగాలు

నిల్వ పరిస్థితులు

0°C లోపు రవాణా మరియు నిల్వ -25～- 15°C.

ప్రోటోకాల్

•DNA టెంప్లేట్ తయారీ

లీనియరైజ్డ్ ప్లాస్మిడ్ DNA, PCR ఉత్పత్తులు లేదా సింథటిక్ DNA ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లను కిట్‌తో ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం టెంప్లేట్‌లుగా ఉపయోగించవచ్చు. DNA టెంప్లేట్‌ను TE బఫర్ లేదా RNase-ఫ్రీ ddH2Oలో కరిగించవచ్చు.

•ప్లాస్మిడ్ టెంప్లేట్లు: లీనియరైజ్డ్ ప్లాస్మిడ్ తప్పనిసరిగా T7 ప్రమోటర్ ప్రాంతాన్ని DNA టెంప్లేట్‌గా కలిగి ఉండాలి.లీనియరైజ్డ్ ప్లాస్మిడ్ యొక్క నాణ్యత RNA యొక్క దిగుబడి మరియు సమగ్రతను ప్రభావితం చేస్తుంది.వృత్తాకార ప్లాస్మిడ్ ప్రభావవంతంగా నిలిపివేయబడనందున, కిట్ యొక్క విజయవంతమైన ఉపయోగం కోసం అత్యధిక స్వచ్ఛతతో పూర్తిగా సరళీకరించబడిన ప్లాస్మిడ్ టెంప్లేట్ కీలకం.అత్యధిక స్వచ్ఛత టెంప్లేట్‌తో అత్యధిక ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ దిగుబడి సాధించబడుతుంది.నిర్వచించిన పొడవు యొక్క RNA ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, ప్లాస్మిడ్ DNA పూర్తిగా మొద్దుబారిన చివరలను లేదా 5'-ఓవర్‌హాంగ్‌లను ఉత్పత్తి చేసే పరిమితి ఎంజైమ్‌తో సరళంగా ఉండాలి.ప్రయోగశాల పద్ధతుల ద్వారా శుద్ధి చేయబడిన లీనియరైజ్డ్ ప్లాస్మిడ్ RNase, ప్రోటీన్, RNA మరియు లవణాలను కలుషితం చేయకుండా ఉంటుంది.

• PCR టెంప్లేట్లు: సరైన ధోరణిలో T7 RNA పాలిమరేస్ ప్రమోటర్‌ను కలిగి ఉన్న PCR ఉత్పత్తులు లిప్యంతరీకరించబడతాయి.PCR మిశ్రమాలను నేరుగా ఉపయోగించవచ్చు అయినప్పటికీ, శుద్ధి చేయబడిన PCR ఉత్పత్తులతో మెరుగైన దిగుబడిని పొందవచ్చు.

•సింథటిక్ DNA ఒలిగాన్యూక్లియోటైడ్లు:సింథటిక్ DNA ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లు పూర్తిగా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ లేదా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌తో ఎక్కువగా సింగిల్ స్ట్రాండెడ్‌గా ఉంటాయి.

RNA సింథసిస్ ప్రోటోకాల్స్

RNase కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి చేతి తొడుగులు ధరించడం మరియు న్యూక్లీజ్ లేని ట్యూబ్‌లు మరియు రియాజెంట్‌లను ఉపయోగించడం గట్టిగా సిఫార్సు చేయబడింది.న్యూక్లీజ్-ఫ్రీ మైక్రోఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు లేదా PCR స్ట్రిప్ ట్యూబ్‌లలో చిన్న వాల్యూమ్ యొక్క ప్రతిచర్యలు అసెంబుల్ చేయాలి.

సంప్రదాయ RNA సంశ్లేషణ

1. ట్యూబ్‌ల దిగువకు సొల్యూషన్‌లను సేకరించడానికి అవసరమైన కిట్ భాగాలను కరిగించి, మైక్రోఫ్యూజ్‌లో కలపండి మరియు పల్స్-స్పిన్ చేయండి.మంచు మీద ఉంచండి.

2.మీరు అనేక ప్రతిచర్యలను అమలు చేయాలని ప్లాన్ చేస్తుంటే, 10× హై-ఇల్డ్ IVT బఫర్ మరియు నాలుగు రిబోన్యూక్లియోటైడ్ (NTP) సొల్యూషన్‌ల సమాన వాల్యూమ్‌లను కలపడం ద్వారా మాస్టర్ మిక్స్‌ను సిద్ధం చేయడం సౌకర్యంగా ఉంటుంది.ప్రతి ప్రతిచర్యకు 10 µl మాస్టర్ మిక్స్ ఉపయోగించండి.

3. కింది క్రమంలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ప్రతిచర్యను సమీకరించండి:

* ఉత్పత్తి యొక్క ఇమ్యునోజెనిసిటీని తగ్గించడానికి, UTPని N1-Me-pUTP ద్వారా అదే చివరి ఏకాగ్రతతో భర్తీ చేయవచ్చు.

4. మైక్రోఫ్యూజ్‌లో పల్స్-స్పిన్ పూర్తిగా కలపండి.37°C వద్ద 2 గంటలు లేదా 50 °C వద్ద 1 గంటకు అధిక ఉష్ణోగ్రత ప్రతిచర్య అవసరమైతే పొదిగేది.

5. DNA జీర్ణక్రియ: టెంప్లేట్ DNAని తీసివేయడానికి, ప్రతి 20 μL ప్రతిచర్యకు 10U DNase Iని జోడించండి, బాగా కలపండి మరియు 30 నిమిషాల పాటు 37℃ వద్ద పొదిగేది.

క్యాప్డ్ RNA సింథసిస్

సాంప్రదాయిక RNA సంశ్లేషణకు సమానమైన ప్రోటోకాల్, ప్రతిచర్యను సమీకరించే దశ మినహా.కింది క్రమంలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద క్యాప్డ్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యను సమీకరించండి:

*** అవసరమైతే, Cap1(3'OH AG) మరియు cap1(3'OMe AG) ascap అనలాగ్‌లను ఉపయోగించవచ్చు.మా కో-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ రియాజెంట్ కో-క్యాపింగ్ T7 ఇన్విట్రో ట్రాన్స్క్రిప్షన్ రియాజెంట్ (pUTP, CAP GAG (3'OMe) , pUTP, CAP GAG, N1-Me- pUTP, CAP GAG (3'OMe) మరియు N1-Me-pUTP, CAPని సిఫార్సు చేయండి GAG.

mRNA శుద్దీకరణ

• ఫినాల్: క్లోరోఫామ్ అదనపుచర్య మరియు ఇథనాల్ అవపాతం

ప్రొటీన్లు మరియు చాలా వరకు ఉచిత న్యూక్లియోటైడ్‌లను తొలగించడానికి, ఫినాల్: క్లోరోఫామ్ వెలికితీత మరియు RNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల ఇథనాల్ అవపాతం ప్రాధాన్య పద్ధతి.

1.160 μL న్యూక్లీజ్ లేని నీటిని జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌ను 180 μLకి సర్దుబాటు చేయండి.20 μL 3M సోడియం అసిటేట్, pH5.2 జోడించండి, పూర్తిగా కలపండి.

2. 1:1 ఫినాల్/క్లోరోఫామ్ మిశ్రమంతో సమాన వాల్యూమ్‌తో సంగ్రహించండి, 5 నిమిషాల పాటు 10000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్.సజల దశను సేకరించి కొత్త గొట్టానికి బదిలీ చేయండి.

3. క్లోరోఫామ్ యొక్క సమాన వాల్యూమ్‌తో రెండు వెలికితీతలు అనుసరించబడతాయి.సజల దశను సేకరించి కొత్త ట్యూబ్‌కు బదిలీ చేయండి.

4. RNA 2 వాల్యూమ్‌ల ఇథనాల్‌తో అవక్షేపించబడింది.కనీసం 30 నిమిషాలు -20℃ వద్ద పొదిగించండి మరియు 15 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ప్యాలెట్‌ను సేకరించండి.సూపర్నాటెంట్‌ను జాగ్రత్తగా తొలగించండి.

5. 150 μL~200 μL చల్లని 70% ఇథనాల్‌తో ప్యాలెట్‌ను శుభ్రం చేయండి.

6. ప్యాలెట్‌ను 2 నిమిషాల పాటు గాలిలో ఆరబెట్టి, 100 μL~200 μL RNase-రహిత నీరు లేదా ఇతర బఫర్‌లలో మళ్లీ అమర్చండి.

• LiCl అవపాతం

RNA యొక్క LiCl అవపాతం ఇన్‌కార్పొరేటెడ్ NTPలు మరియు ఎంజైమ్‌లను తొలగించడంలో ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది.

1. సమాన పరిమాణంలో LiCl ద్రావణాన్ని (5M) జోడించండి, బాగా కలపండి.

2. కనీసం 30 నిమిషాలు -20℃ వద్ద పొదిగే.12000 rpm వద్ద 4℃ వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ 15 నిమిషాల పాటు RNAను ప్యాలెట్ చేయడానికి.సూపర్నాటెంట్‌ను జాగ్రత్తగా తొలగించండి.

3. 200 μL ప్రీకూలింగ్ 70% ఇథనాల్‌ను జోడించడం ద్వారా ప్యాలెట్‌ను రెసిన్ చేయండి.ఇథనాల్‌ను జాగ్రత్తగా తొలగించండి.2-3 సార్లు దశలను పునరావృతం చేయండి.

4. ప్యాలెట్‌ను 5~10 నిమిషాల పాటు గాలిలో ఆరబెట్టి, 100 μL~200 μL RNase-రహిత నీరు లేదా ఇతర బఫర్‌లలో మళ్లీ అమర్చండి.

• స్పిన్ కాలమ్ శుద్దీకరణ

స్పిన్ నిలువు వరుసలు ఇన్కార్పొరేటెడ్ NTPలు, ప్రోటీన్లు మరియు లవణాలను తొలగిస్తాయి.

• అయస్కాంత పూస పూరికల్పన

అయస్కాంత పూసల శుద్దీకరణ ఇన్కార్పొరేటెడ్ న్యూక్లియోటైడ్లు, ప్రోటీన్లు మరియు లవణాలను తొలగించగలదు.

ప్రతిచర్య ఉత్పత్తుల పరిమాణీకరణ

• U ద్వారా పరిమాణీకరణV కాంతి శోషణ: ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులకు శుద్దీకరణ అవసరం ఎందుకంటే ప్రతిచర్య మిశ్రమాలలో ఏదైనా ఇన్‌కార్పొరేటెడ్ న్యూక్లియోటైడ్‌లు మరియు టెంప్లేట్ DNA పఠనాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.UV స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీని 260 nm వద్ద కొలవడం ద్వారా RNA ఏకాగ్రతను సులభంగా పొందవచ్చు.సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ RNA కోసం, 1 A260 40 μg/mL యొక్క RNA సాంద్రతకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.

• పరిమాణీకరణ by రంగు వేయుఇన్కార్పొరేటెడ్ న్యూక్లియోటైడ్‌లు ఆర్‌ఎన్‌ఏ ఉత్పత్తుల మూల్యాంకనాన్ని ప్రభావితం చేయవు కాబట్టి రిబోగ్రీన్ డైతో శుద్ధి చేయకుండానే ప్రతిచర్య ఉత్పత్తుల పరిమాణాన్ని ఉపయోగించవచ్చు.

గమనికలు

• ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్య RNase-రహిత వాతావరణంలో నిర్వహించబడాలి.చేతి తొడుగులు ధరించడం మంచిది.చిట్కాలు, గొట్టాలు మరియు నీరు న్యూక్లీజ్-రహితంగా ఉండాలి.

• NTPల యొక్క అన్ని సరైన తుది సాంద్రత 10 mM, మరియు మీరు వాస్తవ స్థితికి అనుగుణంగా NTPల తుది సాంద్రతను మార్చవచ్చు.

• RNA సంశ్లేషణ ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద సిద్ధం చేయాలి, ఎందుకంటే DNA 4 ° C వద్ద స్పెర్మిడిన్ సమక్షంలో అవక్షేపించవచ్చు.

• టెంప్లేట్ DNA అసంపూర్ణంగా రేఖీయంగా ఉంటే సరైన పొడవు ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ యొక్క దిగుబడి తగ్గుతుంది.

• ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని పైకి లేదా క్రిందికి స్కేల్ చేయవచ్చు.

• బఫర్‌లో మళ్లీ కరిగిన తర్వాత కరగని పదార్థాలు ఉన్నట్లు తేలితే, ఉపయోగం ముందు కరగని పదార్థాలు పూర్తిగా కరిగిపోయే వరకు బఫర్‌ను కలపండి.

• 300 bp కంటే తక్కువ ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌లతో రియాక్షన్‌ల కోసం, 37 ℃ వద్ద 4-8 h ఇంక్యుబేషన్ మీకు అధిక దిగుబడిని ఇస్తుంది.

• ప్రామాణిక RNA సంశ్లేషణ ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌ల కోసం ఉపయోగించే DNA టెంప్లేట్‌లో T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ ఉండాలి, దాని తర్వాత GGG ఇనిషియేషన్ సీక్వెన్స్ ఉండాలి, ఎందుకంటే T7 RNA పాలిమరేస్ GTPకి అధిక అనుబంధాన్ని కలిగి ఉంటుంది.

• కో-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ సిస్టమ్‌తో mRNA సంశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించే DNA టెంప్లేట్ AGG ఇనిషియేషన్ సీక్వెన్స్ తర్వాత T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌ను కలిగి ఉండాలి.

సమస్య పరిష్కరించు

ఎ) ఫుల్-లెన్ తక్కువ దిగుబడిgth RNA:

ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్య పూర్తి-నిడివి గల RNAని ఉత్పత్తి చేస్తే, కానీ దిగుబడి ఊహించిన దాని కంటే గణనీయంగా తక్కువగా ఉంటే, DNA టెంప్లేట్‌లోని కలుషితాలు RNA పాలిమరేస్‌ను నిరోధించే అవకాశం ఉంది లేదా DNA గాఢత చాలా తక్కువగా లేదా తప్పుగా ఉండవచ్చు.

సూచన: DNA టెంప్లేట్ యొక్క అదనపు శుద్దీకరణ సిఫార్సు చేయబడింది.

b) RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ న స్మెరింగ్ డెనాట్మూత్రవిసర్జన జెల్:

అగరోజ్ లేదా పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్‌ను డీనాట్ చేయడంపై RNA క్షీణించినట్లు కనిపిస్తే, DNA టెంప్లేట్ లేదా ప్రయోగ ప్రక్రియ RNaseతో కలుషితమవుతుంది.

సూచన: ప్లాస్మిడ్ DNA టెంప్లేట్ RNaseతో కలుషితమైతే, ఫినాల్/క్లోరోఫామ్ వెలికితీత మరియు ఇథనాల్ అవక్షేపణను నిర్వహించండి.ప్రయోగం సమయంలో ఉపయోగించిన చిట్కాలు మరియు ట్యూబ్‌లు RNase-రహితంగా ఉన్నాయని హామీ ఇవ్వండి.దయచేసి ల్యాబ్ కోట్, మాస్క్ మరియు డిస్పోజబుల్ గ్లోవ్స్ ధరించండి.

సి) RNA యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్ట్ ఊహించిన దాని కంటే పెద్ద పరిమాణం:

డీనాటరింగ్ జెల్‌పై RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ ఊహించిన దానికంటే పెద్దదిగా కనిపిస్తే, టెంప్లేట్ ప్లాస్మిడ్ DNA అసంపూర్ణంగా జీర్ణం కావచ్చు.బలమైన ద్వితీయ నిర్మాణాల ఉనికి RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ పూర్తిగా డీనేచర్ చేయబడదు.

సూచన: పూర్తి జీర్ణక్రియ కోసం టెంప్లేట్‌ను తనిఖీ చేయండి, జీర్ణం కాని ప్లాస్మిడ్ నిర్ధారించబడితే, పరిమితి ఎంజైమ్ జీర్ణక్రియను పునరావృతం చేయండి.సీక్వెన్స్ డిజైన్ దశలో DNA టెంప్లేట్ యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణాలను తగ్గించండి.

d) RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ యొక్క చిన్నది పరిమాణం కంటే ఊహించినవి:

డినాటరింగ్ జెల్ విశ్లేషణ ఆశించిన పరిమాణం కంటే చిన్న బ్యాండ్‌ల ఉనికిని చూపిస్తే, ఇది చాలా మటుకు పాలిమరేస్ ద్వారా అకాల ముగింపు కారణంగా ఉంటుంది.T7 RNA పాలిమరేస్ ముగింపు సంకేతాలను పోలి ఉండే కొన్ని సీక్వెన్సులు అకాల ముగింపుకు కారణమవుతాయి.

సూచన: తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యను పొదిగించడం, ఉదాహరణకు 30°C వద్ద, పూర్తి-నిడివి ట్రాన్స్క్రిప్ట్ యొక్క నిష్పత్తిని పెంచవచ్చు, అయినప్పటికీ దిగుబడి తగ్గుతుంది.GC రిచ్ టెంప్లేట్‌లు లేదా సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌లతో టెంప్లేట్‌ల కోసం, 42°C వద్ద ఇంక్యుబేషన్ పూర్తి-నిడివి ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్ దిగుబడిని మెరుగుపరుస్తుంది.