ఎండోఫ్రీ ప్లాస్మిడ్ మ్యాక్సీ కిట్
ఈ కిట్ 150 - 300 ml బ్యాక్టీరియా ద్రావణాన్ని రాత్రిపూట కల్చర్ చేసి, మెరుగైన SDS-ఆల్కలీన్ లిసిస్ పద్ధతిని ఉపయోగించి బ్యాక్టీరియాను లైస్ చేయడానికి అనుకూలంగా ఉంటుంది.ముడి సారం ఒక ప్రత్యేకమైన ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్‌తో ఎంపిక చేయబడుతుంది మరియు ఎండోటాక్సిన్‌లను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా వేరు చేయబడుతుంది.అప్పుడు, సిలికా జెల్ పొర అధిక ఉప్పు మరియు తక్కువ pH పరిస్థితులలో ద్రావణంలో ప్లాస్మిడ్ DNAతో ఎంపిక చేయబడుతుంది.దీని తర్వాత మలినాలను మరియు ఇతర బాక్టీరియా భాగాలను తొలగించడానికి వాష్ బఫర్‌ని జోడించడం జరుగుతుంది.చివరగా, సిలికాన్ మ్యాట్రిక్స్ మెమ్బ్రేన్ నుండి స్వచ్ఛమైన ప్లాస్మిడ్ DNA ను తొలగించడానికి తక్కువ-ఉప్పు, అధిక-pH ఎల్యూషన్ బఫర్ ఉపయోగించబడుతుంది.సిలికా జెల్ మెమ్బ్రేన్ ప్రత్యేక శోషణ పొరను ఉపయోగిస్తుంది మరియు నిలువు వరుస మరియు నిలువు వరుస మధ్య శోషణ మొత్తం వ్యత్యాసం చాలా తక్కువగా ఉంటుంది మరియు పునరావృత సామర్థ్యం మంచిది.ఫినాల్, క్లోరోఫామ్ మరియు ఇతర విషపూరిత కారకాలు అవసరం లేదు మరియు ఇథనాల్ అవపాతం దశలు కూడా అవసరం లేదు.ఈ కిట్ 80% -90% వెలికితీత రేటుతో 0.2 -1.5 mg స్వచ్ఛమైన హై-కాపీ ప్లాస్మిడ్ DNA ను త్వరితగతిన సేకరించేందుకు ఉపయోగించవచ్చు.కిట్ ఎండోటాక్సిన్‌ను తొలగిస్తుంది, ఎండోటాక్సిన్ కంటెంట్ చాలా తక్కువగా ఉంటుంది మరియు సెల్ ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ ప్రభావం అద్భుతమైనది.వెలికితీసిన ప్లాస్మిడ్‌ను ఎంజైమ్ జీర్ణక్రియ, PCR, ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్, ట్రాన్స్‌ఫర్మేషన్, సీక్వెన్సింగ్ మరియు ఇతర మాలిక్యులర్ బయాలజీ ప్రయోగాలలో నేరుగా ఉపయోగించవచ్చు.
నిల్వ పరిస్థితులు
RNaseAని -30 ~ -15℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి మరియు ≤0℃ వద్ద రవాణా చేయాలి.
ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్‌ను ఒక నెలపాటు 2 ~ 8℃ వద్ద నిల్వ చేయవచ్చు, దీర్ఘకాలిక నిల్వ కోసం -30 ~ -15℃ వద్ద నిల్వ చేయవచ్చుమరియు ≤0℃ వద్ద రవాణా చేయబడుతుంది.
ఇతర భాగాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (15 ~25℃) నిల్వ చేయాలి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద రవాణా చేయాలి.
భాగాలు
| భాగాలు | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| బఫర్ P1 | 75 మి.లీ |
| బఫర్ P2 | 75 మి.లీ |
| బఫర్ P4 | 75 మి.లీ |
| ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్ | 25 మి.లీ |
| బఫర్ PW | 2 × 22 మి.లీ |
| బఫర్ TB | 20 మి.లీ |
| ఫాస్ట్‌ప్యూర్ DNA Maxi నిలువు వరుసలు (ఒక్కొక్కటి 50ml కలెక్షన్ ట్యూబ్‌లో) | 10 |
| ఎండోటాక్సిన్ లేని కలెక్షన్ ట్యూబ్ | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA తొలగించడానికి ఉపయోగిస్తారు.
బఫర్ P1:బ్యాక్టీరియా సస్పెన్షన్ బఫర్, మొదటి ఉపయోగం ముందు RNaseAని బఫర్ P1కి జోడించండి.
బఫర్ P2:బాక్టీరియల్ లిసిస్ బఫర్ (SDS/NaOH కలిగి ఉంటుంది).
బఫర్ P4:తటస్థీకరణ బఫర్.
ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్:ముడి ప్లాస్మిడ్ సారం నుండి ఎండోటాక్సిన్‌ను సమర్థవంతంగా తొలగిస్తుంది.
బఫర్ PW:వాష్ బఫర్, మొదటి ఉపయోగం ముందు ఇథనాల్ యొక్క నిర్దేశించిన వాల్యూమ్ జోడించండి.
బఫర్ TB:ఎలుషన్ బఫర్.
ఫాస్ట్‌ప్యూర్ DNA Maxi నిలువు వరుసలు:ప్లాస్మిడ్ DNA శోషణ నిలువు వరుసలు.
సేకరణ గొట్టాలు 50 ml:వడపోత సేకరణ గొట్టాలు.
ఎండోటాక్సిన్ లేని కలెక్షన్ ట్యూబ్:ప్లాస్మిడ్ DNA సేకరణ గొట్టాలు.
సిద్ధం చేసిన పదార్థాలు
సంపూర్ణ ఇథనాల్, ఐసోప్రొపనాల్, 50 ml రౌండ్-బాటమ్ సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు మరియు 50 ml ఎండోటాక్సిన్-రహితంసెంట్రిఫ్యూజ్ గొట్టాలు.
అప్లికేషన్లు
ఈ ఉత్పత్తి 150 - 300 ml బాక్టీరియల్ ద్రావణం నుండి పెద్ద ఎత్తున ప్లాస్మిడ్ల వెలికితీతకు అనుకూలంగా ఉంటుంది.రాత్రిపూట సంస్కృతి.
ప్రయోగ ప్రక్రియ
1. రాత్రిపూట కల్చర్ చేసిన 150 - 200 ml (300 ml కంటే ఎక్కువ కాదు) బ్యాక్టీరియా ద్రావణాన్ని తీసుకోండి మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి1 - 2 నిమిషాలకు దాదాపు 11,000 rpm (12,000 × g).సూపర్‌నాటెంట్‌ను విస్మరించండి మరియు బ్యాక్టీరియాను సేకరించండి.
Δ 50 ml కంటే ఎక్కువ బ్యాక్టీరియా ద్రావణాన్ని సేకరించేటప్పుడు, బాక్టీరియా ద్రావణం, సెంట్రిఫ్యూగేషన్, సూపర్‌నాటెంట్‌ను విస్మరించడం మరియు అదే 50 ml ట్యూబ్‌లో ఇతర దశలను జోడించడం ద్వారా బ్యాక్టీరియాను సేకరించవచ్చు.
చాలా సార్లు.
2. సెంట్రిఫ్యూజ్‌కి 7.5 ml బఫర్ P1 (దయచేసి RNaseA బఫర్ P1కి జోడించబడిందో లేదో తనిఖీ చేయండి) జోడించండిబాక్టీరియాను కలిగి ఉన్న గొట్టం మరియు సుడి లేదా పైపెటింగ్ ద్వారా పూర్తిగా కలపండి.
Δ ఈ దశలో బాక్టీరియా యొక్క పూర్తి పునఃప్రారంభం దిగుబడికి కీలకం మరియు పునఃప్రారంభించబడిన తర్వాత బ్యాక్టీరియా సమూహాలు ఉండకూడదు.పూర్తిగా మిశ్రమంగా లేని బాక్టీరియా సమూహాలు ఉన్నట్లయితే, అది లైసిస్‌ను ప్రభావితం చేస్తుంది, ఫలితంగా తక్కువ దిగుబడి మరియు స్వచ్ఛత ఏర్పడుతుంది.బాక్టీరియా ద్రావణం యొక్క OD600 0.65 అయితే, 150 ml బాక్టీరియల్ ద్రావణం నుండి సంగ్రహిస్తున్నప్పుడు 7.5 ml బఫర్ P1ని ఉపయోగించాలని సిఫార్సు చేయబడింది;OD600 0.75 అయినప్పుడు, 8 ml బఫర్ P1 వాడాలి మరియు బఫర్స్ P2 మరియు P4 వాల్యూమ్‌లను తదనుగుణంగా మార్చాలి.బ్యాక్టీరియా ద్రావణం యొక్క వాల్యూమ్ 200 ml కు పెరిగినట్లయితే, అది సిఫార్సు చేయబడిందిబఫర్‌ల పరిమాణం P1, P2 మరియు P4 దామాషా ప్రకారం పెంచబడుతుంది.
3. స్టెప్ 2 నుండి బాక్టీరియా సస్పెన్షన్‌కు 7.5 ml బఫర్ P2ని జోడించి, 6 - 8 వరకు మెల్లగా పైకి క్రిందికి కలపండి.సార్లు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 4 - 5 నిమిషాలు పొదిగే.
Δ పూర్తిగా కలపడానికి శాంతముగా విలోమం చేయండి.వోర్టెక్సింగ్ జన్యుసంబంధమైన DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌కు కారణమవుతుంది, దీని ఫలితంగా సంగ్రహించిన ప్లాస్మిడ్‌లో జన్యుసంబంధమైన DNA శకలాలు ఏర్పడతాయి.ఈ సమయంలో, ద్రావణం జిగటగా మరియు అపారదర్శకంగా మారుతుంది, బ్యాక్టీరియా పూర్తిగా లైస్ చేయబడిందని చూపిస్తుంది.ప్లాస్మిడ్లు నాశనం కాకుండా ఉండటానికి వ్యవధి 5 నిమిషాలు మించకూడదు.పరిష్కారం స్పష్టంగా లేకుంటే, చాలా బ్యాక్టీరియా ఫలితంగా ఉండవచ్చుఅసంపూర్ణ లైసిస్, కాబట్టి బ్యాక్టీరియా మొత్తాన్ని తగిన విధంగా తగ్గించాలి.
4. స్టెప్ 3 నుండి బాక్టీరియా సస్పెన్షన్‌కు 7.5 ml బఫర్ P4ని జోడించండి మరియు బఫర్ P2ని పూర్తిగా తటస్థీకరించడానికి ద్రావణాన్ని అనుమతించడానికి వెంటనే 6 - 8 సార్లు సున్నితంగా విలోమం చేయండి.ఈ సమయంలో, తెల్లటి ఫ్లోక్యులెంట్ అవక్షేపం కనిపించాలి.10 - 15 నిమిషాలకు సుమారు 11,000 rpm (12,000 × g) కంటే ఎక్కువ సెంట్రిఫ్యూజ్, సూపర్‌నాటెంట్‌ను కొత్త 50 ml రౌండ్-బాటమ్ సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లోకి జాగ్రత్తగా పైప్పెట్ చేయండి (స్వీయ-సిద్ధం), మరియు నివారించండితేలియాడే తెల్లని అవక్షేపాన్ని ఆశించండి.
Δ బఫర్ P4ని జోడించండి మరియు బాగా కలపడానికి వెంటనే విలోమం చేయండి.తటస్థీకరణను ప్రభావితం చేసే స్థానిక అవపాతం ఉత్పత్తిని నిరోధించడానికి ద్రావణం అంతటా తెల్లని అవక్షేపం సమానంగా పంపిణీ చేయబడే వరకు ట్యూబ్‌ని నిలబడనివ్వండి.సెంట్రిఫ్యూగేషన్‌కు ముందు ఏకరీతి తెల్లని ఫ్లోక్యులెంట్ అవక్షేపం లేనట్లయితే మరియు అపకేంద్రీకరణ తర్వాత సూపర్‌నాటెంట్ స్పష్టంగా లేకుంటే, ట్యూబ్ ఇలా ఉంటుందిమరో 5 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది.
5. ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్‌ను 4వ దశ నుండి సూపర్‌నాటెంట్‌కు 0. 1 రెట్లు (అపర్‌నాటెంట్ వాల్యూమ్‌లో 10%, సుమారు 2.2 మి.లీ) జోడించి, కలపడానికి విలోమం చేయండి.ద్రావణాన్ని ఐస్ బాత్‌లో ఉంచండి లేదా ద్రావణం టర్బిడ్ నుండి స్పష్టమైన మరియు పారదర్శకంగా (లేదా ఇప్పటికీ) మారే వరకు 5 నిమిషాల పాటు పిండిచేసిన ఐస్ (లేదా రిఫ్రిజిరేటర్ ఫ్రీజర్) లోకి చొప్పించండి.కొద్దిగా గందరగోళంగా), మరియు అప్పుడప్పుడు చాలా సార్లు కలపాలి.
Δ ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్‌ను సూపర్‌నాటెంట్‌కు జోడించిన తర్వాత, సూపర్‌నాటెంట్ గందరగోళంగా మారుతుంది.ఐస్ బాత్‌లో చల్లబడిన తర్వాత సూపర్‌నాటెంట్ స్పష్టంగా (లేదా కొద్దిగా గందరగోళంగా) ఉండాలి.
6. సూపర్‌నాటెంట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (>25℃) 10 - 15 నిమిషాలు ఉంచిన తర్వాత, అది గందరగోళంగా మారుతుందిదాని ఉష్ణోగ్రత గది ఉష్ణోగ్రతకు పెరుగుతుంది.అప్పుడు సూపర్‌నాటెంట్‌ను కలపడానికి విలోమం చేయాలి.
Δ గది ఉష్ణోగ్రత తక్కువగా ఉంటే లేదా మీరు వెలికితీసే సమయాన్ని తగ్గించాలనుకుంటే, సూపర్‌నాటెంట్‌ను 37 ~ 42 ℃ నీటి స్నానంలో 5 - 10 నిమిషాలు పొదిగించవచ్చు మరియు సూపర్‌నాటెంట్ తర్వాత తదుపరి దశను నిర్వహించవచ్చు.టర్బిడ్ అవుతుంది.
7. దశను వేరు చేయడానికి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు (ఉష్ణోగ్రత తప్పనిసరిగా >25℃) 11,000 rpm (12,000 × g) వద్ద సూపర్‌నాటెంట్‌ను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.ఎగువ సజల దశలో DNA ఉంటుంది, అయితే దిగువ నీలిరంగు ఆయిల్ ఫేజ్ పొర ఎండోటాక్సిన్ మరియు ఇతర మలినాలను కలిగి ఉంటుంది.బదిలీ చేయండిDNA-కలిగిన సజల దశ కొత్త గొట్టం మరియుజిడ్డుగల పొరను విస్మరించండి.
Δ ప్రభావవంతమైన దశ వేరు చేయనందున సెంట్రిఫ్యూగేషన్ సమయంలో ఉష్ణోగ్రత తప్పనిసరిగా 25℃ కంటే ఎక్కువగా ఉండాలిఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే సంభవిస్తుంది.
Δ దశల విభజన ప్రభావవంతంగా లేకుంటే, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ఉష్ణోగ్రతను 30℃కి సర్దుబాటు చేయవచ్చు మరియుసెంట్రిఫ్యూగేషన్ సమయాన్ని 15 నిమిషాలకు పెంచవచ్చు.
Δ ఎండోటాక్సిన్ మరియు ఇతర మలినాలను కలిగి ఉన్నందున నీలం జిడ్డు పొరను పీల్చుకోవద్దు.
మెకానిజం
రిసస్పెన్షన్ లైసిస్ న్యూట్రలైజేషన్
◇ 7.5 ml బఫర్ P1ని జోడించండి
◇ 7.5 ml బఫర్ P2ని జోడించండి
◇ 7.5 ml బఫర్ P4ని జోడించండి
ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపు
◇ఎండోటాక్సిన్ స్కావెంజర్ యొక్క సూపర్‌నాటెంట్ వాల్యూమ్ కంటే 0. 1 రెట్లు జోడించండి
బైండింగ్ మరియు వాషింగ్
◇ ఐసోప్రొపనాల్ వాల్యూమ్ కంటే 0.5 రెట్లు జోడించండి
◇ 10 ml బఫర్ PW జోడించండి
◇ 10 ml బఫర్ PW జోడించండి
ఎలుషన్
◇ 1 - 2 ml బఫర్ TB లేదా ఎండోటాక్సిన్ లేని ddH2O జోడించండి
