వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్

వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్, వ్యాక్సినియా క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ కోసం జన్యువులను తీసుకువెళ్లే రీకాంబినెంట్ ఇ.కోలి స్ట్రెయిన్ నుండి తీసుకోబడింది.ఈ సింగిల్ ఎంజైమ్ రెండు సబ్‌యూనిట్‌లతో (D1 మరియు D12) రూపొందించబడింది మరియు మూడు ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను కలిగి ఉంటుంది (D1 సబ్‌యూనిట్ ద్వారా RNA ట్రైఫాస్ఫేటేస్ మరియు గ్వానైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ మరియు D12 సబ్‌యూనిట్ ద్వారా గ్వానైన్ మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్).వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ క్యాప్ నిర్మాణాన్ని ఉత్ప్రేరకపరచడానికి ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది, ఇది ప్రత్యేకంగా 7-మిథైల్‌గ్వానైలేట్ క్యాప్ స్ట్రక్చర్ (m7Gppp, Cap 0)ని RNA యొక్క 5′ చివరకి జోడించగలదు.యూకారియోట్లలో mRNA స్థిరీకరణ, రవాణా మరియు అనువాదంలో క్యాప్ నిర్మాణం (Cap 0) ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది.ఎంజైమాటిక్ రియాక్షన్ ద్వారా RNA క్యాపింగ్ అనేది ఒక ప్రభావవంతమైన మరియు సరళమైన పద్ధతి, ఇది ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్, ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ మరియు మైక్రోఇన్‌జెక్షన్ కోసం RNA యొక్క స్థిరత్వం మరియు అనువాదాన్ని గణనీయంగా మెరుగుపరుస్తుంది.

భాగాలు

వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ (10 U/μL)

10×క్యాపింగ్ బఫర్

నిల్వ పరిస్థితులు

-25～- 15℃ నిల్వ కోసం

నిల్వ బఫర్

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% ట్రిటాన్ X- 100, 50% గ్లిసరాల్.

యూనిట్ నిర్వచనం

వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ యొక్క ఒక యూనిట్ 37°C వద్ద 1 గంటలో 80nt ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌లో 10pmol GTPని చేర్చడానికి అవసరమైన ఎంజైమ్ మొత్తంగా నిర్వచించబడింది.

నాణ్యత నియంత్రణ

ఎక్సోన్యూకలీస్:10U ఆఫ్ వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్‌తో 1μg λ-హింద్ III డైజెస్ట్ DNA 37 ℃ 16 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించినట్లుగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

ఎండోన్యూక్లీస్:10U వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్‌తో 1μg λDNA 37℃ వద్ద 16 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ నిర్ణయించినట్లుగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

నికేస్:10U యొక్క వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ 1 μg pBR322తో 37 ℃ వద్ద 16 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించినట్లుగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

RNase:37℃ వద్ద 1.6μg MS2 RNAతో 10U వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ 4 గంటల పాటు అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన విధంగా ఎటువంటి క్షీణతను అందించదు.

1.కోలి DNA:10U యొక్క వ్యాక్సినియా వైరస్ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ E. coli 16S rRNA లోకస్ కోసం ప్రత్యేకమైన ప్రైమర్‌లతో TaqMan qPCRని ఉపయోగించి E. కోలి జెనోమిక్ DNA ఉనికి కోసం పరీక్షించబడింది.E. కోలి జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యం ≤1 E. కోలి జన్యువు.

2.బాక్టీరియల్ ఎండోటాక్సిన్: LAL-పరీక్ష, చైనీస్ ఫార్మకోపోయియా IV 2020 ఎడిషన్ ప్రకారం, జెల్ పరిమితి పరీక్ష పద్ధతి, సాధారణ నియమం (1143).బాక్టీరియల్ ఎండోటాక్సిన్ కంటెంట్ ≤10 EU/mg ఉండాలి.

ప్రతిచర్య వ్యవస్థ మరియు పరిస్థితులు

1. క్యాపింగ్ ప్రోటోకాల్ (రియాక్షన్ వాల్యూమ్: 20 μL)

ఈ విధానం 10μg RNA (≥100 nt) యొక్క క్యాపింగ్ రియాక్షన్‌కు వర్తిస్తుంది మరియు ప్రయోగాత్మక డిమాండ్‌ల ప్రకారం దీనిని స్కేల్ చేయవచ్చు.

I) 1.5 ml మైక్రోఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో 10μg RNA మరియు న్యూక్లీజ్-ఫ్రీ H2Oని 15.0 µL తుది వాల్యూమ్‌కు కలపండి.*10×క్యాపింగ్ బఫర్: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) 65℃ వద్ద 5 నిమిషాలు వేడి చేయండి, తర్వాత 5 నిమిషాలు ఐస్ బాత్ చేయండి.

3) పేర్కొన్న క్రమంలో కింది భాగాలను జోడించండి

*10×క్యాపింగ్ బఫర్: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 30 నిమిషాల పాటు 37°C వద్ద పొదిగే, RNA ఇప్పుడు క్యాప్ చేయబడింది మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ అప్లికేషన్‌ల కోసం సిద్ధంగా ఉంది.

2. 5′ టెర్మినల్ లేబులింగ్ ప్రతిచర్య (ప్రతిస్పందన వాల్యూమ్: 20 μL)

ఈ ప్రోటోకాల్ 5´ ట్రైఫాస్ఫేట్‌ను కలిగి ఉన్న RNAను లేబుల్ చేయడానికి రూపొందించబడింది మరియు ఇది డిమాండ్‌ల ప్రకారం స్కేల్ చేయబడుతుంది.లేబుల్ ఇన్‌కార్పొరేషన్ యొక్క సామర్థ్యం RNA యొక్క మోలార్ నిష్పత్తి: GTP, అలాగే RNA నమూనాలలోని GTP కంటెంట్ ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.

1) 1.5 ml మైక్రోఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో తగిన మొత్తంలో RNA మరియు న్యూక్లీజ్-ఫ్రీ H2Oని 14.0 µL తుది వాల్యూమ్‌కు కలపండి.

2) 65℃ వద్ద 5 నిమిషాలు వేడి చేయండి, తర్వాత 5 నిమిషాలు ఐస్ బాత్ చేయండి.

3) పేర్కొన్న క్రమంలో కింది భాగాలను జోడించండి.

** GTP MIX GTP మరియు తక్కువ సంఖ్యలో గుర్తులను సూచిస్తుంది.GTP ఏకాగ్రత కోసం, చూడండిగమనిక 3.

4) 30 నిమిషాల పాటు 37°C వద్ద పొదిగేది, RNA 5′ ముగింపు ఇప్పుడు లేబుల్ చేయబడింది మరియు దిగువకు సిద్ధంగా ఉంది

అప్లికేషన్లు

1. అనువాద పరీక్షలు/ఇన్ విట్రో అనువాదానికి ముందు mRNA క్యాపింగ్

2. mRNA యొక్క 5´ ముగింపును లేబులింగ్ చేయడం

ఉపయోగంపై గమనికలు

1.వ్యాక్సినియా క్యాపింగ్ ఎంజైమ్‌తో పొదిగే ముందు ఆర్‌ఎన్‌ఏ ద్రావణాన్ని వేడి చేయడం వల్ల ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్ యొక్క 5వ చివరన ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని తొలగిస్తుంది.తెలిసిన అత్యంత నిర్మాణాత్మకమైన 5´ఎండ్స్‌తో ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల కోసం సమయాన్ని 60 నిమిషాలకు పొడిగించండి.

2. క్యాపింగ్ రియాక్షన్‌లకు ఉపయోగించే ఆర్‌ఎన్‌ఏను ఉపయోగించే ముందు శుద్ధి చేయాలి మరియు న్యూక్లీజ్ లేని నీటిలో సస్పెండ్ చేయాలి.EDTA ఉండకూడదు మరియు పరిష్కారం లవణాలు లేకుండా ఉండాలి.

3. 5´ ముగింపును లేబుల్ చేయడానికి, మొత్తం GTP ఏకాగ్రత ప్రతిచర్యలో mRNA యొక్క మోలార్ సాంద్రత కంటే 1-3 రెట్లు ఉండాలి.

4. రియాక్షన్ సిస్టమ్ యొక్క వాల్యూం వాస్తవ ప్రకారం పైకి లేదా క్రిందికి స్కేల్ చేయబడుతుంది.