నేరుగా PCR కిట్‌ను నాటండి
పిల్లి సంఖ్య: HCR2020A
ప్లాంట్ డైరెక్ట్ PCR కిట్ మొక్క ఆకులు, విత్తనాలు మొదలైన వాటి యొక్క ప్రత్యక్ష విస్తరణకు అనుకూలంగా ఉంటుంది మరియు పాలీశాకరైడ్‌లు మరియు పాలీఫెనాల్స్ లేని మొక్కల నమూనాల అధిక-నిర్గమాంశ స్క్రీనింగ్ కోసం ఉపయోగించవచ్చు.దర్శకత్వం వహించిన పరిణామంపై ఆధారపడిన డైరెక్ట్ యాంప్లిఫికేషన్ DNA పాలిమరేస్ మొక్కలలోని PCR ఇన్హిబిటర్‌లకు అత్యుత్తమ సహనాన్ని కలిగి ఉంటుంది.ఇంతలో, ఇది అధిక యాంప్లిఫికేషన్ పనితీరును నిర్వహిస్తుంది, ఇది 5 kb లోపల DNA శకలాలు విస్తరించడానికి అనుకూలంగా ఉంటుంది.కిట్‌లోని ప్రత్యేకమైన లైసిస్ బఫర్ Aని తాజా లేదా ఘనీభవించిన మొక్కల కణజాలాలను లైస్ చేయడానికి ఉపయోగించవచ్చు.ఇది ఆపరేట్ చేయడం సులభం మరియు లైసేట్‌ను శుద్ధి చేయకుండా యాంప్లిఫికేషన్ కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు.సిస్టమ్‌లో రక్షిత ఏజెంట్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి ముడి నమూనాలను పదేపదే గడ్డకట్టడం మరియు కరిగించిన తర్వాత సమర్థవంతంగా విస్తరించేలా చేస్తాయి.2 × ప్లాంట్ డైరెక్ట్ మాస్టర్ మిక్స్ యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్‌ని నిర్వహించడానికి ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌లను మాత్రమే జోడించాలి, తద్వారా పైప్‌టింగ్ ఆపరేషన్‌లను తగ్గిస్తుంది మరియు డిటెక్షన్ త్రూపుట్ మరియు ఫలితాల పునరుత్పత్తిని మెరుగుపరుస్తుంది.
భాగాలు
| భాగాలు | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × ప్లాంట్ డైరెక్ట్ మాస్టర్ మిక్స్ | 1.25 మి.లీ | 4×1.25 మి.లీ |
| ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ A | 5 మి.లీ | 20 మి.లీ |
| ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ B* | 5 మి.లీ | 20 మి.లీ |
*ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ B అనేది ఒక ఐచ్ఛిక రియాజెంట్, ఇది నమూనాల నిల్వ సమయాన్ని పొడిగించడం కోసం ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ Aని తటస్థీకరించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది.ఇది వాస్తవ పరిస్థితికి అనుగుణంగా ఉపయోగించవచ్చు.
నిల్వ పరిస్థితులు
2 × ప్లాంట్ డైరెక్ట్ మాస్టర్ మిక్స్, -30 ~ -15℃ వద్ద నిల్వ చేయండి మరియు పదేపదే గడ్డకట్టడం మరియు కరిగించడం నివారించండి;ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్, -30 ~ -15℃ లేదా 2 ~ 8℃ వద్ద నిల్వ చేయండి.
ప్రయోగ ప్రక్రియ
నమూనా ప్రాసెసింగ్–మొక్క ఆకు
ప్రత్యక్ష పద్ధతి:యువ ఆకులను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.చిన్న మరియు ఏకరీతి నమూనాను పొందేందుకు 0.5 - 3 మిమీ స్థిర వ్యాసం కలిగిన రంధ్రం పంచ్‌ను ఉపయోగించండి, ఆపై నేరుగా PCR సిస్టమ్‌కు నమూనాను జోడించండి (50 μl సిస్టమ్ సిఫార్సు చేయబడింది).గమనిక, నమూనా PCR ద్రావణంలో ఉందని మరియు ట్యూబ్ గోడకు వ్యతిరేకంగా లేదని నిర్ధారించుకోండి.పొడవాటి శకలాలు మరియు సంక్లిష్ట నమూనాలను విస్తరించడానికి డైరెక్ట్ PCR ఉపయోగించినట్లయితే, చిన్న వ్యాసం (0.5 - 1 మిమీ) కలిగిన నమూనాను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించడం వలన మెరుగైన ఫలితాలను పొందడంలో సహాయపడుతుంది.
గ్రౌండింగ్ లైసిస్ పద్ధతి:యువ ఆకులను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.ఒక చిన్న ఆకు ముక్కను (సుమారు 1 – 3 మిమీ వ్యాసం) తీసుకోండి, దానిని 20 μl ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ అబ్‌లో ఉంచండి మరియు వీలైనంత వరకు గ్రైండ్ చేయండి (ఈ దశను 100 μl పైపెట్ చిట్కాతో ఆకును పిండడం ద్వారా చేయవచ్చు. నమూనాను మాష్ చేయడానికి) .ఆకు కణజాలం యొక్క పెద్ద వాల్యూమ్‌లను ఉపయోగించినట్లయితే (7 మిమీ మించకూడదు), పలుచన బఫర్ వాల్యూమ్‌ను 50 μlకి పెంచండి.ఆకులు నేల తర్వాత, పరిష్కారం ఆకుపచ్చగా కనిపించాలి.సంక్షిప్త సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, 1 μl సూపర్‌నాటెంట్‌ను PCR సిస్టమ్‌కు ప్రతిచర్య టెంప్లేట్‌గా జోడించండి.
థర్మల్ లైసిస్ పద్ధతి:యువ ఆకులను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.ఒక చిన్న ఆకు ముక్కను (సుమారు 1 - 3 మిమీ వ్యాసం) తీసుకోండి, దానిని 20 μl ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ Aలో ఉంచండి మరియు దానిని 95 ° C వద్ద 5 - 10 నిమిషాలు వేడి చేయండి.లైస్ చేయడం కష్టంగా ఉండే ఆకులకు (20 నిమిషాల కంటే ఎక్కువ సమయం ఉండదు) లైసిస్ సమయాన్ని తగిన విధంగా పొడిగించవచ్చు.ఆకు కణజాలం యొక్క పెద్ద వాల్యూమ్‌లను ఉపయోగించినట్లయితే (7 మిమీ మించకూడదు), పలుచన బఫర్ వాల్యూమ్‌ను 50 μlకి పెంచండి.వేడి చేసిన తర్వాత, క్లుప్తంగా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి మరియు 1 μl సూపర్‌నాటెంట్‌ను PCR సిస్టమ్‌కు ప్రతిచర్య టెంప్లేట్‌బ్‌గా జోడించండి.
నమూనా ప్రాసెసింగ్- మొక్క విత్తనం
గ్రౌండింగ్ లైసిస్ పద్ధతి:5 మిమీ వ్యాసంతో విత్తనాలను కత్తిరించడానికి స్కాల్పెల్‌ని ఉపయోగించండి, వాటిని 100 μl ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ Aకి జోడించి, పైపెట్ చిట్కా లేదా ఇతర సాధనాలతో నమూనాను గ్రైండ్ చేయండి.క్లుప్తంగా సుడిగుండం మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 3 - 5 నిమిషాలు నిలబడనివ్వండి.విత్తన నమూనా పలుచన బఫర్‌లో మునిగిపోయిందని నిర్ధారించుకోండి.సంక్షిప్త సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, రియాక్షన్ టెంప్లేట్‌గా PCR సిస్టమ్‌కు 1 μl సూపర్‌నాటెంట్‌ని జోడించండి.
థర్మల్ లైసిస్ పద్ధతి:5 మిమీ వ్యాసంతో విత్తనాలను కత్తిరించడానికి స్కాల్పెల్‌ని ఉపయోగించండి, వాటిని 100 μl ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ Aకి జోడించి, 95 ° C వద్ద 5 - 10 నిమిషాలు వేడి చేయండి.లైస్ చేయడం కష్టంగా ఉండే ఆకులకు (30 నిమిషాల కంటే ఎక్కువ సమయం ఉండదు) లైసిస్ సమయాన్ని తగిన విధంగా పొడిగించవచ్చు.వేడి చేసిన తర్వాత, క్లుప్తంగా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి మరియు 1 μl సూపర్‌నాటెంట్‌ను PCR సిస్టమ్‌కు ప్రతిచర్య టెంప్లేట్‌గా జోడించండి.
a.కత్తెరలు లేదా ఇతర సాధనాలను కూడా తగిన పరిమాణంలోని నమూనాలను కత్తిరించడానికి ఉపయోగించవచ్చు;పంచ్ లేదా కత్తెరను మళ్లీ ఉపయోగించినట్లయితే, నమూనాల మధ్య క్రాస్-కాలుష్యాన్ని నిరోధించడానికి ప్రతి ఉపయోగం ముందు వాటిని 2% సోడియం హైపోక్లోరైట్ ద్రావణంతో శుభ్రం చేయాలి.
బి.ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ పూర్తిగా కరిగిపోయిందని నిర్ధారించుకోండి.బఫర్ జిగటగా ఉన్నట్లయితే లేదా అవక్షేపణలను కలిగి ఉన్నట్లయితే, దానిని 37℃ వద్ద వేడి చేసి వాడే ముందు పూర్తిగా కరిగించవచ్చు.
సి.ప్రతిచర్య వ్యవస్థలోని టెంప్లేట్ వాల్యూమ్‌ను మొక్కల పదార్థం మరియు జోడించిన పలుచన పరిమాణంలోని వ్యత్యాసానికి అనుగుణంగా తగిన విధంగా సర్దుబాటు చేయవచ్చు.
ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్
ఈ ఉత్పత్తిలో ఉన్న ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ A చాలా మొక్కల కణజాలాల జన్యువును విడుదల చేయడానికి ఖచ్చితంగా ఆప్టిమైజ్ చేయబడింది మరియు 4℃ వద్ద ముడి మొక్కలను స్వల్పకాలిక నిల్వ చేయడానికి అనుకూలంగా ఉంటుంది.నమూనాను ఎక్కువ కాలం (ఉదా, 1 – 2 నెలలు) నిల్వ చేయవలసి వస్తే, సూపర్‌నాటెంట్‌ను కొత్త EP ట్యూబ్‌కి బదిలీ చేసి -20℃ వద్ద నిల్వ చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.నమూనాలను మరింత స్థిరంగా నిల్వ చేయడానికి, బదిలీ చేయబడిన సూపర్‌నాటెంట్‌కు సమాన పరిమాణంలో ప్లాంట్ డైరెక్ట్ లైసిస్ బఫర్ Bని జోడించండి, బాగా కలపండి మరియు -20℃ వద్ద నిల్వ చేయండి.మొక్కల నమూనాలు మరియు రాష్ట్రాలతో స్థిరమైన నిల్వ సమయం మారుతూ ఉంటుంది.
ప్రతిచర్య వ్యవస్థ
| ddH2O | 20.0 µl వరకు | 50.0 µl వరకు |
| 2 × ప్లాంట్ డైరెక్ట్ మాస్టర్ మిక్స్a | 10.0 µl | 25.0 µ |
| ప్రైమర్ 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ప్రైమర్ 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| మొక్క ఆకు/ముడి సారం నమూనా(నమూనా ప్రాసెసింగ్‌ని చూడండి) | 0.5 - 3 మిమీ లీఫ్ డిస్క్/x µl | 0.5 - 3 మిమీ లీఫ్ డిస్క్/x µl |
a.ఇందులో Mg ఉంటుంది2+2 mM తుది సాంద్రత వద్ద.
బి.ప్రతి ప్రైమర్ కోసం 0.4μM తుది సాంద్రతను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.ప్రైమర్‌లను అధికంగా ఉపయోగించడం వలన నిర్ధిష్ట విస్తరణ పెరుగుతుంది.
సి.ఉపయోగించిన నమూనా మొత్తాన్ని వాస్తవ పరిస్థితికి అనుగుణంగా సర్దుబాటు చేయవచ్చు.క్రూడ్ లైస్డ్ శాంపిల్ యొక్క ఒకే రియాక్షన్‌లో ఉపయోగించిన మొత్తాన్ని రియాక్షన్ యొక్క మొత్తం వాల్యూమ్‌లో 2% - 20% మధ్య సర్దుబాటు చేయవచ్చు.చాలా ఎక్కువ నమూనాలను ఉపయోగించడం వల్ల యాంప్లిఫికేషన్ వైఫల్యం సంభవించవచ్చు.
ప్రతిచర్య కార్యక్రమం
| దశలు | ఉష్ణోగ్రత | సమయం |
| ప్రారంభ డీనాటరేషన్ | 98℃ | 5 నిమి |
| డీనాటరేషన్ | 95℃ | 10 సె |
| ఎనియలింగ్ | 58 ~ 72℃ | 15 సె |
| పొడిగింపు | 72℃ | 30 సె |
| చివరి పొడిగింపు | 72℃ | 5 నిమి |
a.ప్రారంభ డీనాటరేషన్ (98℃, 5 నిమి) మొక్కల కణజాలం యొక్క లైసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది, PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించబడే జన్యుసంబంధమైన DNAని విడుదల చేస్తుంది.సమయాన్ని తగ్గించవద్దు లేదా ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించవద్దు.
బి.ఇది ప్రైమర్ Tm విలువకు సమానంగా లేదా Tm విలువ కంటే 2 ~ 4℃ ఎక్కువగా సెట్ చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.ఈ ఉత్పత్తిలో ఉపయోగించిన డైరెక్ట్ యాంప్లిఫికేషన్ DNA పాలిమరేస్ సంప్రదాయ Taq DNA పాలిమరేస్‌కు భిన్నంగా ఉంటుంది మరియు రియాక్షన్ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు ప్రత్యేక అవసరాలు ఉంటాయి; అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించడం వల్ల నిర్దిష్టత లేని యాంప్లిఫికేషన్‌ను సమర్థవంతంగా తగ్గించవచ్చు మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరుస్తుంది.సంక్లిష్ట టెంప్లేట్‌ల కోసం, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సర్దుబాటు చేయడం మరియు పొడిగింపు సమయాన్ని పొడిగించడం ద్వారా సమర్థవంతమైన విస్తరణను సాధించవచ్చు.
సి.యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు ≤1 kb అయితే, పొడిగింపు సమయం 30 సెకను/kbకి సెట్ చేయబడుతుంది;యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు >1 kb అయితే, పొడిగింపు సమయం 60 సెకను/kbకి సెట్ చేయబడుతుంది.
డి.తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ దిగుబడి ఉన్న సంక్లిష్ట నమూనాలు లేదా నమూనాల కోసం, చక్రాల సంఖ్యను తగిన విధంగా 40 -50 సైకిళ్లకు పెంచవచ్చు.
అప్లికేషన్లు
మొక్కల కణజాలం యొక్క ప్రత్యక్ష విస్తరణకు మరియు పాలీసాకరైడ్‌లు మరియు పాలీఫెనాల్స్ లేని మొక్కల నమూనాల అధిక-నిర్గమాంశ స్క్రీనింగ్‌కు ఇది వర్తిస్తుంది.
గమనికలు
పరిశోధన ఉపయోగం కోసం మాత్రమే.రోగనిర్ధారణ ప్రక్రియలలో ఉపయోగం కోసం కాదు.
1. క్రూడ్ ప్లాంట్ యాంప్లిఫికేషన్ లేదా డైరెక్ట్ యాంప్లిఫికేషన్ కోసం, సిస్టమ్, ప్రైమర్‌లు మరియు ఆపరేషన్‌లు సరిగ్గా ఉన్నాయని నిర్ధారించుకోవడానికి ప్రయోగాన్ని ప్రారంభించే ముందు శుద్ధి చేయబడిన జన్యుసంబంధమైన DNAని సానుకూల నియంత్రణగా ఉపయోగించాలని సిఫార్సు చేయబడింది.
2. ఈ కిట్‌లో ఉపయోగించిన డైరెక్ట్ యాంప్లిఫికేషన్ DNA పాలిమరేస్ బలమైన ప్రూఫ్ రీడింగ్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉంది.TA క్లోనింగ్ చేయవలసి వస్తే, అడెనైన్‌ను జోడించే ముందు DNA ను శుద్ధి చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.
3. ప్రైమర్ డిజైన్ గైడెన్స్:
a.ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివర చివరి బేస్ G లేదా C అని సిఫార్సు చేయబడింది.
బి.ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివర చివరి 8 బేస్‌లలో వరుసగా అసమతుల్యతలను నివారించాలి.సి.ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివర హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాలను నివారించండి.
డి.ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్ యొక్క Tm విలువలో తేడాలు 1℃ కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు మరియు Tm విలువను 60 ~ 72℃కి సర్దుబాటు చేయాలి (Tm విలువను లెక్కించడానికి ప్రైమర్ ప్రీమియర్ 5 సిఫార్సు చేయబడింది).
ఇ.ప్రైమర్ Tm విలువను గణిస్తున్నప్పుడు టెంప్లేట్‌తో సరిపోలని అదనపు అదనపు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లను చేర్చకూడదు.
f.ప్రైమర్ యొక్క GC కంటెంట్ 40% -60% ఉండాలని సిఫార్సు చేయబడింది.
g.ప్రైమర్‌లో A, G, C మరియు T యొక్క మొత్తం పంపిణీ సాధ్యమైనంత సమానంగా ఉండాలి.అధిక GC లేదా AT కంటెంట్‌లు ఉన్న ప్రాంతాలను ఉపయోగించడం మానుకోండి.
h.ప్రైమర్ లోపల లేదా రెండు ప్రైమర్‌ల మధ్య 5 లేదా అంతకంటే ఎక్కువ బేస్‌ల కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌ల ఉనికిని నివారించండి మరియు రెండు ప్రైమర్‌ల 3′ ముగింపులో 3 లేదా అంతకంటే ఎక్కువ బేస్‌ల కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌ల ఉనికిని నివారించండి.
i.నాన్‌స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌ను నిరోధించడానికి ప్రైమర్ యొక్క నిర్దిష్టతను తనిఖీ చేయడానికి NCBI BLAST ఫంక్షన్‌ని ఉపయోగించండి.
