డబుల్ స్ట్రాండెడ్ RNA (dsRNA) ELISA KIT

ఈ కిట్ అనేది ఎంజైమ్-లింక్డ్ ఇమ్యునోసోర్బెంట్ అస్సే (ELISA) బయోటిన్-స్ట్రెప్టావిడిన్ సిస్టమ్‌తో కలపడం, సీక్వెన్స్‌తో సంబంధం లేకుండా 60 బేస్ జతల (bp) కంటే ఎక్కువ పొడవుతో dsRNA యొక్క పరిమాణాత్మక కొలత కోసం.ప్లేట్ యాంటీ-డిఎస్ఆర్ఎన్ఎ యాంటీబాడీతో ముందే పూత చేయబడింది.నమూనాలో ఉన్న dsRNA జోడించబడింది మరియు బావులపై పూసిన ప్రతిరోధకాలతో బంధిస్తుంది.ఆపై బయోటైనిలేటెడ్ యాంటీ-డిఎస్‌ఆర్‌ఎన్‌ఎ యాంటీబాడీ జోడించబడింది మరియు నమూనాలోని డిఎస్‌ఆర్‌ఎన్‌ఎతో బంధిస్తుంది.కడిగిన తర్వాత, HRP-Streptavidin జోడించబడింది మరియు బయోటైనిలేటెడ్ యాంటీ-డిఎస్ఆర్ఎన్ఎ యాంటీబాడీకి బంధిస్తుంది.పొదిగే తర్వాత అన్‌బౌండ్ HRP-స్ట్రెప్టావిడిన్ కొట్టుకుపోతుంది.అప్పుడు TMB సబ్‌స్ట్రేట్ సొల్యూషన్ జోడించబడింది మరియు ఆమ్ల స్టాప్ సొల్యూషన్‌ను జోడించిన తర్వాత పసుపు రంగులోకి మారిన నీలం రంగు ఉత్పత్తిని ఉత్పత్తి చేయడానికి HRP ద్వారా ఉత్ప్రేరకమవుతుంది.పసుపు యొక్క సాంద్రత ప్లేట్‌లో సంగ్రహించబడిన dsRNA యొక్క లక్ష్య మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది.శోషణం 450 nm వద్ద కొలుస్తారు.

అప్లికేషన్

ఈ కిట్ అవశేష dsRNA యొక్క పరిమాణాత్మక కొలత కోసం.

కిట్ భాగాలు

నిల్వ మరియు స్థిరత్వం

1. ఉపయోగించని కిట్ కోసం: మొత్తం కిట్ షెల్ఫ్ జీవితంలో 2~8℃ వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.నిల్వ స్థిరత్వం కోసం బలమైన కాంతిని నివారించాలి.

2. ఉపయోగించిన కిట్ కోసం: మైక్రోప్లేట్ తెరిచిన తర్వాత, దయచేసి ఉపయోగించని బావులను ప్లేట్ సీలర్‌తో కప్పి, డెసికాంట్ ప్యాక్ ఉన్న ఫాయిల్ పర్సు వద్దకు తిరిగి వెళ్లండి, ఫాయిల్ పర్సును జిప్-సీల్ చేసి, ఉపయోగించిన తర్వాత వీలైనంత త్వరగా 2~8℃కి తిరిగి వెళ్లండి.ఇతర కారకాలను ఉపయోగించిన తర్వాత వీలైనంత త్వరగా 2~8℃కి తిరిగి ఇవ్వాలి.

అవసరమైన పదార్థాలు కానీ సరఫరా చేయబడలేదు

1. 450±10nm ఫిల్టర్‌తో మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (450 మరియు 650 nm తరంగదైర్ఘ్యం వద్ద గుర్తించగలిగితే మంచిది).

2. మైక్రోప్లేట్ షేకర్.

3. RNase-రహిత చిట్కాలు మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు.

ఆపరేషన్ ఫ్లోచార్ట్

మీరు ప్రారంభించడానికి ముందు

1. అన్ని కిట్ భాగాలు మరియు నమూనాలను ఉపయోగించే ముందు గది ఉష్ణోగ్రతకు (18-25℃) తీసుకురండి.కిట్ ఒకే సమయంలో ఉపయోగించబడకపోతే, దయచేసి ప్రస్తుత ప్రయోగం కోసం స్ట్రిప్స్ మరియు రియాజెంట్‌లను మాత్రమే తీసివేసి, మిగిలిన స్ట్రిప్స్ మరియు రియాజెంట్‌లను అవసరమైన స్థితిలో ఉంచండి.

2. వాష్ బఫర్: 800mL 1× వాష్ బఫర్‌ను సిద్ధం చేయడానికి 760mL డీయోనైజ్డ్ లేదా డిస్టిల్డ్ వాటర్‌తో 40mL 20× గాఢమైన వాష్ బఫర్‌ను పలుచన చేయండి.

3. ప్రామాణికం: ఉపయోగం ముందు స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను క్లుప్తంగా తిప్పండి లేదా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.అందించిన నాలుగు ప్రమాణాల గాఢత 5ng/μL.UTP మరియు pUTP dsRNA ప్రమాణాల కోసం, స్టాండర్డ్ కర్వ్‌ను గీయడానికి దయచేసి స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μLకి STE బఫర్‌తో పలుచన చేయండి.N1-Me-pUTP dsRNA ప్రమాణాల కోసం, స్టాండర్డ్ కర్వ్‌ను గీయడానికి దయచేసి స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μLకి STE బఫర్‌తో పలుచన చేయండి.5-OMe-UTP dsRNA ప్రమాణం కోసం, దయచేసి స్టాండర్డ్ కర్వ్‌ను గీయడానికి స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μLకి STE బఫర్‌తో పలుచన చేయండి.ప్రమాణాలను క్రింది చార్ట్‌ల వలె పలుచన చేయవచ్చని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము:

4. బయోటైనిలేటెడ్ డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ మరియు HRP-స్ట్రెప్టావిడిన్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్: ఉపయోగం ముందు స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను క్లుప్తంగా తిప్పండి లేదా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.పలుచన బఫర్‌తో పని చేసే ఏకాగ్రతకు వాటిని పలుచన చేయండి.

5. TMB సబ్‌స్టేట్: స్టెరిలైజ్ చేసిన చిట్కాలతో ద్రావణం యొక్క అవసరమైన మోతాదును ఆశించండి మరియు అవశేష ద్రావణాన్ని మళ్లీ సీసాలో వేయవద్దు.TMB సబ్‌స్టేట్ కాంతికి సున్నితంగా ఉంటుంది, TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను ఎక్కువ కాలం కాంతికి బహిర్గతం చేయవద్దు.

ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించడం

1. పరీక్షకు అవసరమైన స్ట్రిప్‌ల సంఖ్యను నిర్ణయించండి.ఉపయోగం కోసం ఫ్రేమ్‌లలో స్ట్రిప్‌లను చొప్పించండి.ఈ పరీక్షలో ఉపయోగించని మిగిలిన ప్లేట్ స్ట్రిప్స్‌ను డెసికాంట్‌తో బ్యాగ్‌లో మళ్లీ ప్యాక్ చేయాలి.రిఫ్రిజిరేటెడ్ నిల్వ కోసం బ్యాగ్‌ను గట్టిగా మూసివేయండి.

2. సముచితమైన బావులలోకి ప్రామాణిక, ఖాళీ మరియు నమూనాల ప్రతి పలుచన 100μL జోడించండి.ప్లేట్ సీలర్‌తో కవర్ చేయండి.500rpm వద్ద వణుకుతో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1గం పొదిగే.ఖచ్చితమైన పరీక్ష కోసం నమూనాలను తగిన ఏకాగ్రతతో STE బఫర్‌తో కరిగించాలి.

3. వాష్ స్టెప్: ద్రావణాన్ని ఆస్పిరేట్ చేయండి మరియు ప్రతి బావికి 250μL వాష్ బఫర్‌తో కడగాలి మరియు దానిని 30 సెకన్ల పాటు నిలబడనివ్వండి.శోషక కాగితంపై ప్లేట్‌ను స్నాప్ చేయడం ద్వారా వాష్ బఫర్‌ను పూర్తిగా విస్మరించండి.పూర్తిగా 4 సార్లు కడగాలి.

4. ప్రతి బావిలో 100μL బయోటైనిలేటెడ్ డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ వర్కింగ్ సొల్యూషన్‌ను జోడించండి.ప్లేట్ సీలర్‌తో కవర్ చేయండి.500rpm వద్ద వణుకుతో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1గం పొదిగే.

5. వాష్ దశను పునరావృతం చేయండి.

6. ప్రతి బావిలో 100μL HRP-స్ట్రెప్టావిడిన్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్‌ను జోడించండి.ప్లేట్ సీలర్‌తో కవర్ చేయండి.500rpm వద్ద వణుకుతో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించండి.

7. మళ్ళీ వాష్ దశను పునరావృతం చేయండి.

8. ప్రతి బావిలో 100μL TMB సబ్‌స్ట్రేట్ ద్రావణాన్ని జోడించండి.ప్లేట్ సీలర్‌తో కవర్ చేయండి.కాంతి నుండి RT ప్రొటెక్ట్ వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగే.సబ్‌స్ట్రేట్ ద్రావణాన్ని జోడించడం ద్వారా ద్రవం నీలం రంగులోకి మారుతుంది.

9. ప్రతి బావిలో 50μL స్టాప్ సొల్యూషన్ జోడించండి.స్టాప్ సొల్యూషన్ జోడించడం ద్వారా ద్రవం పసుపు రంగులోకి మారుతుంది.ఆపై మైక్రోప్లేట్ రీడర్‌ను అమలు చేయండి మరియు వెంటనే 450nm వద్ద కొలతను నిర్వహించండి.

ఫలితాల గణన

1. ప్రతి స్టాండర్డ్, కంట్రోల్ మరియు శాంపిల్స్ కోసం డూప్లికేట్ రీడింగ్‌లను సరాసరి చేయండి మరియు సగటు జీరో స్టాండర్డ్ ఆప్టికల్ డెన్సిటీని తీసివేయండి.నిలువు(Y) అక్షంపై శోషణ మరియు క్షితిజసమాంతర (X）అక్షం)పై dsRNA ఏకాగ్రతతో ప్రామాణిక వక్రరేఖను రూపొందించండి.

2. 5 లేదా 4 పారామీటర్ నాన్-లీనియర్ ఫిట్ మోడల్‌లో కర్వ్ ఎక్స్‌పర్ట్ 1.3 లేదా ELISA Calc వంటి కంప్యూటర్ ఆధారిత కర్వ్-ఫిట్టింగ్ సాఫ్ట్‌వేర్‌తో గణనను నిర్వహించాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

ప్రదర్శన

1. సున్నితత్వం:

గుర్తించే తక్కువ పరిమితి: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA కోసం), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA కోసం).

తక్కువ పరిమాణం పరిమితి:0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA కొరకు),0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA కొరకు),0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA కొరకు).

2. ఖచ్చితత్వం: ఇంట్రా-అస్సే యొక్క CV ≤10%, ఇంటర్-అస్సే యొక్క CV ≤10%

3. రికవరీ:80%~120%

4.లీనియారిటీ:0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA కోసం)0.0312-1pg/μL(ForN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA కోసం).

పరిగణనలు

1. TMB ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రత మరియు సమయం కీలకం, దయచేసి వాటిని సూచనల ప్రకారం ఖచ్చితంగా నియంత్రించండి.

2. మంచి పరీక్ష పునరుత్పత్తి మరియు సున్నితత్వాన్ని సాధించడానికి, అదనపు అన్-రియాక్ట్ రియాజెంట్‌లను తొలగించడానికి ప్లేట్‌లను సరిగ్గా కడగడం అవసరం.

3. అన్ని రియాజెంట్‌లను ఉపయోగించే ముందు పూర్తిగా కలపాలి మరియు నమూనా లేదా రియాజెంట్‌ల జోడింపు సమయంలో బంబుల్‌లను నివారించాలి.

4. సాంద్రీకృత వాష్ బఫర్ (20x)లో స్ఫటికాలు ఏర్పడినట్లయితే, 37℃ వరకు వేడి చేసి, స్ఫటికాలు పూర్తిగా కరిగిపోయే వరకు మెత్తగా కలపండి.

5. సోడియం అజైడ్ (NaN3)ని కలిగి ఉన్న నమూనాల పరీక్షను నివారించండి, ఎందుకంటే ఇది HRP కార్యాచరణను నాశనం చేస్తుంది, ఫలితంగా dsRNA మొత్తం తక్కువగా అంచనా వేయబడుతుంది.

6. పరీక్ష సమయంలో RNase కాలుష్యాన్ని నివారించండి.

7. స్టాండర్డ్/నమూనా, డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ మరియు SA-HRP కూడా వణుకు లేకుండా RT వద్ద నిర్వహించబడతాయి, అయితే ఇది గుర్తించే సున్నితత్వం ఒక రెట్లు తగ్గడానికి కారణం కావచ్చు.ఈ సందర్భంలో, UTP మరియు pUTP dsRNA ప్రమాణాలను 2pg/μL నుండి పలుచన చేయాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము, N1-Me-pUTP dsRNA ప్రమాణాలను 4pg/μL నుండి పలుచన చేయాలి మరియు 5-OMe-UTP dsRNA ప్రమాణాన్ని 8pg/μL నుండి పలుచన చేయాలి.అదనంగా, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 60 నిమిషాల పాటు HRP-స్ట్రెప్టావిడిన్ వర్కింగ్ సొల్యూషన్‌ను పొదిగించండి.ఫ్లాస్క్ షేకర్‌ని ఉపయోగించవద్దు, ఎందుకంటే ఫ్లాస్క్ షేకర్ సరైన ఫలితానికి దారితీయవచ్చు.

సాధారణ ఫలితం

1. స్టాండర్డ్ కర్వ్ డేటా

2. ప్రామాణిక వక్రత గణన

3. లైనర్ డిటెక్షన్ పరిధి:0.0312- 1pg/μL