DNA వెలికితీత మినీ కిట్
ఈ కిట్ ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన బఫర్ సిస్టమ్ మరియు సిలికా జెల్ కాలమ్ ప్యూరిఫికేషన్ టెక్నాలజీని అవలంబిస్తుంది, ఇది TAE లేదా TBE అగరోస్ జెల్ యొక్క వివిధ సాంద్రతల నుండి 70 bp - 20 kb DNA శకలాలు తిరిగి పొందగలదు.DNA అధిశోషణం కాలమ్ ప్రత్యేకంగా అధిక-ఉప్పు స్థితిలో DNAను శోషించగలదు.అదనంగా, కిట్ నేరుగా PCR ఉత్పత్తులు, ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్య వ్యవస్థలు లేదా ఇతర పద్ధతుల ద్వారా పొందిన ముడి DNA ఉత్పత్తుల నుండి DNA శకలాలను శుద్ధి చేయగలదు మరియు ప్రోటీన్లు, ఇతర కర్బన సమ్మేళనాలు, అకర్బన ఉప్పు అయాన్లు మరియు ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రైమర్‌ల వంటి మలినాలను తొలగించగలదు.ఇది 10-15 నిమిషాలలోపు శుద్దీకరణ పూర్తవుతుందని నిర్ధారిస్తుంది.శుద్ధి చేయబడిన DNA నేరుగా లిగేషన్, ట్రాన్స్‌ఫర్మేషన్, ఎంజైమ్ డైజెషన్, ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్, PCR, సీక్వెన్సింగ్, మైక్రోఇన్‌జెక్షన్ మొదలైన వాటికి ఉపయోగించవచ్చు.
నిల్వ పరిస్థితులు
-15 ~ -25℃ వద్ద నిల్వ చేయండి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద రవాణా చేయండి.
భాగాలు
| భాగాలు | (100 rxns) |
| బఫర్ GDP | 80 మి.లీ |
| బఫర్ GW | 2 × 20 మి.లీ |
| ఎలుషన్ బఫర్ | 20 మి.లీ |
| ఫాస్ట్‌ప్యూర్ DNA మినీ నిలువు వరుసలు-G | 100 |
బఫర్ GDP:DNA బైండింగ్ బఫర్.
బఫర్ GW:వాషింగ్ బఫర్;ఉపయోగం ముందు సీసాపై సూచించిన వాల్యూమ్ ద్వారా సంపూర్ణ ఇథనాల్ జోడించండి.
ఎల్యూషన్ బఫర్:ఎలుషన్.
ఫాస్ట్‌ప్యూర్ DNA మినీ నిలువు వరుసలు-G:DNA శోషణ నిలువు వరుసలు.
సేకరణ గొట్టాలు 2 ml:ఫిల్ట్రేట్ కోసం సేకరణ గొట్టాలు.
సిద్ధం చేసిన పదార్థాలు
1.5 ml స్టెరిలైజ్డ్ ట్యూబ్‌లు, సంపూర్ణ ఇథనాల్ మరియు ఐసోప్రొపనాల్ (DNA ఫ్రాగ్మెంట్ ≤100 bp అయినప్పుడు, 1 వాల్యూమ్ జోడించండి
ఐసోప్రొపనాల్ 1 వాల్యూమ్ జెల్), నీటి స్నానం.
ప్రయోగ ప్రక్రియ
ఉపయోగించే ముందు ట్యాగ్‌పై సూచించిన విధంగా బఫర్ GW పలుచన చేయడానికి 80 ml ఇథనాల్‌ను జోడించండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిల్వ చేయండి.
మెకానిజం
1. PCR ప్రతిచర్య పరిష్కారం
జెల్ వెలికితీత పథకం: సమాన వాల్యూమ్ బఫర్ GDP PCR రియాక్షన్ సొల్యూషన్ రికవరీ స్కీమ్‌ను జోడించండి:వాల్యూమ్ బఫర్‌కు 5 రెట్లు జోడించండి
2. GDP జెల్ వాల్యూమ్‌ను లెక్కించండి (100 μl 100 mg సమానం)
జెల్ కరిగించండి
3. 50 ~ 55 వద్ద ముందుగా వేడి చేయండి℃
4. బైండ్ వాష్
300 μL బఫర్ GDP*ని జోడించండి
700 μL బఫర్ GWని జోడించండి
700 μL బఫర్ GWని జోడించండి
5. ఎలుట్
20 - 30μL ఎలుషన్ బఫర్ లేదా డీయోనైజ్డ్ వాటర్ జోడించండి
గమనికలు* ఈ దశ లేకుండా PCR ప్రతిచర్య ద్రవం రికవరీ
జెల్ వెలికితీత కార్యక్రమం
1. DNA శకలాలను విభజించడానికి DNA ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ తర్వాత, UV కాంతి కింద అగరోజ్ జెల్ నుండి DNA ముక్క యొక్క సింగిల్ స్ట్రిప్‌ను ఎక్సైజ్ చేయండి.జెల్ యొక్క స్పష్టమైన తేమను గ్రహించడానికి శోషక కాగితాన్ని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది మరియు వీలైనంత వరకు అదనపు అగరోజ్‌ను తీసివేయడం ద్వారా జెల్ స్లైస్ పరిమాణాన్ని తగ్గించండి.దాని వాల్యూమ్‌ను లెక్కించడానికి జెల్ స్లైస్ (మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్ లేకుండా) తూకం వేయండి: 100 mg జెల్‌లైస్ వాల్యూమ్ సుమారు 100 μL, సాంద్రత 1g/ml అని ఊహిస్తే.
2. సమాన వాల్యూమ్ బఫర్ GDPని జోడించండి, 50~55℃ వద్ద 7-10 నిమిషాలు పొదిగేది (జెల్ పరిమాణం ప్రకారం, జెల్ పూర్తిగా కరిగిపోయే వరకు ఇంక్యుబేషన్ సమయాన్ని సర్దుబాటు చేయండి).పొదిగే సమయంలో ట్యూబ్‌ను 2 సార్లు తిప్పండి.
Δ బఫర్ GDP యొక్క 1-3 వాల్యూమ్‌ల జోడింపు DNA రికవరీ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేయదు.ఒకవేళ DNA భాగాన్ని తిరిగి పొందాలంటే <100 bp, బఫర్ GDP యొక్క 3 వాల్యూమ్‌లను జోడించాలి;జెల్ స్లైస్ పూర్తిగా కరిగిపోయినప్పుడు, 1 వాల్యూమ్ ఐసోప్రొపనాల్ వేసి బాగా కలపండి, తర్వాత తదుపరి దశకు కొనసాగించండి.
3. నమూనాను ట్యూబ్ దిగువకు తీసుకురావడానికి క్లుప్తంగా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి, ఫాస్ట్‌ప్యూర్ DNA మినీ కాలమ్‌లు-Gని 2 ml కలెక్షన్ ట్యూబ్‌లలోకి చొప్పించండి, గరిష్టంగా 700 μL ఒకసారి ద్రావణాన్ని జాగ్రత్తగా బదిలీ చేయండి
వడపోత కాలమ్‌లకు సమయం, 30-60 సెకన్లకు 12,000 rpm (13,800 X g) వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్.
4. ఫిల్ట్రేట్ను విస్మరించి, కాలమ్‌కు 300 μL బఫర్ GDPని జోడించండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 నిమి, సెంట్రిఫ్యూజ్‌ని 12,000 rpm (13,800 X g) వద్ద 30-60 సెకన్ల పాటు పొదిగించండి.
5. ఫిల్ట్రేట్ను విస్మరించి, 700 μL బఫర్ GW (పూర్వమైన ఇథనాల్ జోడించబడిందో లేదో తనిఖీ చేయండి!) కాలమ్‌కు జోడించండి, 30-60 సెకన్ల పాటు 12,000 rpm (13,800 X g) వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.
Δ దయచేసి శోషణ కాలమ్ గోడ చుట్టూ బఫర్ GWని జోడించండి లేదా బఫర్ GW బ్యాక్ కవర్‌ని జోడించి, ట్యూబ్ గోడకు అతుక్కుపోయిన ఉప్పును పూర్తిగా ఫ్లష్ చేయడంలో సహాయపడటానికి 2 - 3 సార్లు తలక్రిందులుగా కలపండి.
6. దశ 5ని పునరావృతం చేయండి.
Δ బఫర్ GWతో రెండుసార్లు ఫ్లషింగ్ చేయడం వల్ల ఉప్పు పూర్తిగా తీసివేయబడిందని మరియు తదుపరి ప్రయోగాలపై ప్రభావం లేకుండా చేస్తుంది.
7. ఫిల్ట్రేట్ను విస్మరించండి మరియు 2 నిమిషాల పాటు 12,000 rpm (13,800 X g) వద్ద ఖాళీ కాలమ్‌ను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.
8. క్లీన్ 1.5 ml మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో కాలమ్‌ను చొప్పించండి, 20 - 30 μL ఎలుషన్ బఫర్‌ను కాలమ్ మెమ్బ్రేన్ మధ్యలో చేర్చండి, 2 నిమిషాలు పొదిగేది, ఆపై 1 నిమికి 12,000 rpm (13,800 X g) వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.నిలువు వరుసను విస్మరించండి, పొందిన DNAని -20 వద్ద నిల్వ చేయండి.
Δ స్టెప్ 8 యొక్క సూపర్‌నాటెంట్‌ను మళ్లీ ఎల్యూట్ చేయడానికి కాలమ్‌కు బదిలీ చేయడం మరియు ఎలుషన్ బఫర్‌ను 55కి ప్రీహీట్ చేయడం (DNA ఫ్రాగ్మెంట్ >3 kb ఉన్నప్పుడు) రికవరీ సామర్థ్యాన్ని పెంచడానికి సహాయపడవచ్చు.
PCR ఉత్పత్తుల రికవరీ ప్రోగ్రామ్
ఈ ప్రోటోకాల్ PCR ఉత్పత్తులు, ఎంజైమాటిక్ రియాక్షన్ సిస్టమ్ మరియు ఇతర DNA ముడి ఉత్పత్తుల (జన్యు DNAతో సహా) నుండి DNA శకలాలను శుద్ధి చేయడానికి వర్తిస్తుంది.ఈ పరిష్కారం వివిధ న్యూక్లియోటైడ్‌లు, ప్రైమర్‌లు, ప్రైమర్ డైమర్‌లు, ఉప్పు అణువులు, ఎంజైమ్‌లు మరియు ఇతర మలినాలను సమర్థవంతంగా తొలగించగలదు.
1. క్లుప్తంగా సెంట్రిఫ్యూజ్ PCR ఉత్పత్తులు, ఎంజైమాటిక్ రియాక్షన్ సొల్యూషన్ మరియు ఇతర DNA ముడి ఉత్పత్తులు.పైపెట్‌తో వాటి వాల్యూమ్‌ను అంచనా వేయండి మరియు క్రిమిరహితం చేసిన 1.5 ml లేదా 2 ml ట్యూబ్‌కు బదిలీ చేయండి.వాల్యూమ్ 100 μL వరకు ddH2O జోడించండి;అధిక సాంద్రత కలిగిన జన్యుసంబంధమైన DNA కోసం, ddH2Oతో 300 μL వరకు పలుచన చేయడం వల్ల రికవరీ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరుస్తుంది.
2. బఫర్ GDP యొక్క 5 వాల్యూమ్‌లను జోడించండి, విలోమం లేదా వోర్టెక్సింగ్ ద్వారా పూర్తిగా కలపండి.ఆసక్తి ఉన్న DNA భాగం>100 bp అయితే, అదనంగా 1.5 వాల్యూమ్‌లు (నమూనాలు + బఫర్ GDP) ఇథనాల్ జోడించాలి.
3. కాలమ్‌ను తిరిగి సేకరణ ట్యూబ్‌లోకి చొప్పించండి, మిశ్రమాన్ని కాలమ్‌కు బదిలీ చేయండి, సెంట్రిఫ్యూజ్ 12,000 rpm (13,800 ×g) వద్ద 30 - 60 సెకన్లు.మిశ్రమ ద్రావణం యొక్క పరిమాణం >700 µL అయితే, శోషణ కాలమ్‌ను తిరిగి సేకరణ ట్యూబ్‌లోకి ఉంచండి, మిగిలిన సొల్యూషన్‌ను అధిశోషణ కాలమ్‌కు బదిలీ చేయండి మరియు 30 - 60 సెకన్ల పాటు 12,000 rpm (13,800 × g) వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.
4. తదుపరి పనితీరు 08- 1/జెల్ వెలికితీత ప్రోగ్రామ్ యొక్క 5 - 8 దశను సూచిస్తుంది.
అప్లికేషన్లు
TAE లేదా TBE అగరోజ్ జెల్ యొక్క వివిధ సాంద్రతలు;PCR ఉత్పత్తులు, ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్య వ్యవస్థలు లేదా వివిధ పద్ధతుల ద్వారా పొందిన ఇతర ముడి DNA ఉత్పత్తులు.నుండి కోలుకున్న శకలాలు ఉన్నాయి70 bp -20 kb.
గమనికలు
పరిశోధన ఉపయోగం కోసం మాత్రమే.రోగనిర్ధారణ ప్రక్రియలలో ఉపయోగం కోసం కాదు.
1. ఉపయోగించడానికి ముందు ట్యాగ్‌పై సూచించిన విధంగా బఫర్ GWను పలుచన చేయడానికి 80 ml ఇథనాల్‌ను జోడించండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిల్వ చేయండి.
2. తక్కువ-ఉష్ణోగ్రత నిల్వ సమయంలో బఫర్ GDP అవక్షేపించడం సులభం అయితే, దానిని ఉపయోగించే ముందు కొంత సమయం వరకు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఉంచవచ్చు.అవసరమైతే, అవక్షేపం పూర్తిగా కరిగిపోయే వరకు దీనిని 37℃ నీటి స్నానంలో ముందుగా వేడి చేయవచ్చు, ఆపై దానిని మిక్సింగ్ తర్వాత ఉపయోగించవచ్చు.
3. నీటి స్నానం ఉష్ణోగ్రతను ముందుగానే 50 ~55℃కి సెట్ చేయండి.
4. 08-1/జెల్ వెలికితీత ప్రోగ్రామ్ స్టెప్ 1లో, జెల్ స్లైస్ పరిమాణాన్ని కనిష్టీకరించడం వలన కరిగిపోయే సమయాన్ని గణనీయంగా తగ్గిస్తుంది మరియు రికవరీ సామర్థ్యాన్ని పెంచుతుంది (రేఖీయీకరించిన DNA అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిరంతరం బహిర్గతం అయినప్పుడు సులభంగా హైడ్రోలైజ్ అవుతుంది).అతినీలలోహిత కాంతి DNA దెబ్బతినవచ్చు కాబట్టి, DNA జెల్‌ను UVకి ఎక్కువ కాలం బహిర్గతం చేయవద్దు.
5. 08- 1/జెల్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ ప్రోగ్రామ్ స్టెప్ 2లో జెల్‌ను పూర్తిగా కరిగించండి, లేకుంటే DNA రికవరీ సామర్థ్యం తీవ్రంగా ప్రభావితమవుతుంది.
6. డీఎన్‌ఏ ఎలుషన్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచడానికి సహాయపడే ఎలుషన్ బఫర్ లేదా ddH2O ను 55℃ వరకు వేడి చేయండి.DNA ని 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 ఎలుయెంట్‌లో నిల్వ చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.
