ఎన్-గ్లైకాన్ కిట్

భాగాలు

N-గ్లైకాన్ కిట్(24T)

ప్రోటోకాల్

మీరు ప్రారంభించడానికి ముందు వినియోగదారు కింది కారకాలు మరియు పరికరాలను సిద్ధం చేయాలి (ఉదాహరణకు ఒక IgG నమూనా):

(1) 0.85% Nacl, 100µL;అసిటోనిట్రైల్ (LC-MS గ్రేడ్) అల్ట్రాపుర్ వాటర్;

(2)15/85=అల్ట్రాపుర్ వాటర్/ఎసిటోనిట్రైల్ సొల్యూషన్ (v/v), 2mL;1/9/90=ఫార్మిక్ యాసిడ్/అల్ట్రాపుర్ వాటర్/ఎసిటోనిట్రైల్(v/v) ,20mL；50 mM అమ్మోనియం ఫార్మేట్,PH=4.4 ,500mL;

(3) SPE వాక్యూమ్ పంప్;96-బావి-ప్లేట్ నెగటివ్ ప్రెజర్ ప్రాసెసర్ లేదా పాజిటివ్ ప్రెజర్ ప్రాసెసర్;హీటింగ్ మాడ్యూల్ లేదా మెటల్ బాత్ (90℃ మరియు 50℃) ;వోర్టెక్స్ మిక్సర్;పైపెట్.

దశ 1: రాపిడ్ డీగ్లైకోసైలేషన్

(1) 2mg/mL వద్ద IgG తుది ఏకాగ్రతను పొందడానికి IgG నమూనాను 0.85% Naclతో పలుచన చేయండి.

(2) PNGase F బఫర్: (24μL/72μL))PNGase F బఫర్‌తో 1 పగిలి సర్ఫాక్టెంట్ (1.2mg/3.6mg)ను పలుచన చేయండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద కలపండి మరియు నిల్వ చేయండి (ఈ ద్రావణాన్ని ఉపయోగించే ముందు సిద్ధం చేయాలి) .

(3) 200μL రియాక్షన్ ట్యూబ్‌కు 20μL IgG ద్రావణాన్ని జోడించండి, 3μL PNGase F బఫర్‌ను కలపండి, పైపెట్ పైకి క్రిందికి కలపండి మరియు ఆపై 3.3μL అల్ట్రాపుర్ వాటర్, ఆస్పిరేట్ మరియు కలపడానికి పంపిణీ చేయండి.

(4) 90℃,3 నిమిషాల వద్ద హీటింగ్ మాడ్యూల్‌కు పైన పేర్కొన్న అన్ని ద్రావణాన్ని జోడించి, దానిని డీనేచర్ చేసి, ఆపై హీటింగ్ మాడ్యూల్ నుండి బయటకు తీసి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 3 నిమిషాలు చల్లబరచండి.

(5) 1.2μL PNGase F, ఆస్పిరేట్‌ని కలపండి మరియు కలపడానికి పంపిణీ చేయండి, హీటింగ్ మాడ్యూల్‌తో 50℃, 5 నిమిషాలు వేడి చేయండి.వినియోగదారు వేచి ఉన్నప్పుడు లేబులింగ్ రియాజెంట్‌ని సిద్ధం చేయవచ్చు.

(6) హీటింగ్ మాడ్యూల్ నుండి తీసివేసి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 3 నిమిషాలు చల్లబరచండి.

దశ 2. గ్లైకోసైలమైన్స్ యొక్క వేగవంతమైన లేబులింగ్

(1) లేబులింగ్ రియాజెంట్ సొల్యూషన్: ఒక సీసా లేబులింగ్ రియాజెంట్ （8.2mg/24.6m）అన్‌హైడ్రస్ DMF(60. 13μL/180.4μL)తో పలుచన చేయండి, ఈ ద్రావణాన్ని ఉపయోగించే ముందు తయారుచేయాలి), 5-10 సార్లు ఆశించి పంపిణీ చేయాలి కారకం పూర్తిగా కరిగిపోతుంది.

(2) రియాక్షన్ ట్యూబ్‌కు 6μL లేబులింగ్ రియాజెంట్ సొల్యూషన్‌ను జోడించి, మిక్సింగ్‌ని నిర్ధారించడానికి 5-10 సార్లు ఆస్పిరేట్ చేసి, ఆపై లేబులింగ్ ప్రతిచర్యను గదిలో కొనసాగించడానికి అనుమతించండి.

5 నిమిషాలు ఉష్ణోగ్రత.

(3) 179 μL అసిటోనిట్రైల్‌ను జోడించండి, తదుపరి దశ కోసం కలపండి.

దశ 3: శుభ్రపరచడం గ్లైకోసైలా అని లేబుల్ చేయబడిందిగనులు

(1) నెగటివ్ ప్రెజర్ ప్రాసెసర్ లేదా పాజిటివ్ ప్రెజర్ ప్రాసెసర్ మరియు 96-వెల్ ఎలుషన్ ప్లేట్‌ను సెటప్ చేయండి.

(2) కండిషన్ బావులు: బావులను కండిషన్ చేయడానికి ఎలుషన్ ప్లేట్‌కు 200μL అల్ట్రాపుర్ నీటిని జోడించండి, వ్యర్థ ట్రే ద్వారా వ్యర్థాలను సేకరించండి.

(3)బావులు సమతౌల్యం చేయండి: బావులను సమతుల్యం చేయడానికి 200μL 15/85 నీరు/అసిటోనిట్రైల్ ద్రావణాన్ని (v/v) జోడించండి, వ్యర్థాల ట్రే ద్వారా వ్యర్థాలను సేకరించండి.

(4 ) నమూనాను లోడ్ చేయండి: ఎసిటోనిట్రైల్ పలచబరిచిన నమూనాలను లోడ్ చేయండి మరియు వేస్ట్ ట్రే ద్వారా వ్యర్థాలను సేకరించండి.

(5) 600μL 1/9/90 ఫార్మిక్ యాసిడ్/అల్ట్రాపుర్ వాటర్/ఎసిటోనిట్రైల్(v/v)తో బావులను రెండుసార్లు కడగాలి మరియు వ్యర్థాలను వేస్ట్ ట్రే ద్వారా సేకరించండి.

(6) వేస్ట్ ట్రేని తీసివేసి, దానిని కలెక్షన్ ప్లేట్‌గా మార్చండి.

(7) 50μL ఎల్యూషన్ బఫర్‌తో సెల్‌ను కడగాలి, సేకరణ ప్లేట్‌కు ఎల్యూట్ గ్లైకాన్‌లు, మరియు ఈ దశను పునరావృతం చేయండి.

(8) 200μL నమూనా పలచనను జోడించండి, దానిని కలపండి.

దశ 4. HILIC-FLR

(1) క్రోమాటోగ్రఫీ కాలమ్: ACQUITY UPLC® గ్లైకాన్ BEH అమైడ్, 130 Å, 1.7 μm, 2. 1 x 150 mm(వాటర్స్ పార్ట్ #186004742).

(2) కాలమ్ ఉష్ణోగ్రత: 60 °C

(3) లిక్విడ్ ఫేజ్ A：50 mM అమ్మోనియం ఫార్మేట్ సొల్యూషన్ (LC-MS గ్రేడ్ సిఫార్సు చేయబడింది), pH=4.4.

(4) లిక్విడ్ ఫేజ్ B: 100% అసిటోనిట్రైల్ (LC-MS గ్రేడ్సిఫార్సు చేయబడింది).

(5) ఫ్లో రేట్: 0.4 mL/min;

(6) గ్రేడియంట్:

(7)FLR తరంగదైర్ఘ్యాలు: EX 265/EM 425 nm

(8)FLR నమూనా రేటు: 2 Hz

(9)ఇంజెక్షన్ వాల్యూమ్.: 10μL

దయచేసి "ACQUITY® RDa"LCMSతో అమర్చబడిన మెషీన్ ఆధారంగా పై పారామీటర్‌లు, వినియోగదారు ఇతర పరికరాలపై తదనుగుణంగా పారామీటర్‌ను సర్దుబాటు చేయగలరని దయచేసి గమనించండి.

Sపశుగ్రాసము

గమనికలు

మీ భద్రత మరియు ఆరోగ్యం కోసం, దయచేసి ల్యాబ్ కోటు మరియు చేతి తొడుగులు ధరించండి.

ప్రతిసారీ శుభ్రమైన చిట్కాలను ఉపయోగించండి

దయచేసి రియాజెంట్‌లను నిల్వ చేయడానికి మరియు ఉపయోగించడానికి మాన్యువల్‌ని అనుసరించండి